雙向調控

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雙向調控范文第1篇

【關鍵詞】金融調控 房地產 金融 雙向影響

房地產行業在近年來的發展中取得了較好的經濟效益，房地產行業的規模逐漸擴大，對國家的經濟建設做出了重要的貢獻。但是當前我國的房地產行業發展過快，房價增長過快，這對于房地產行業的長遠發展有著十分不利的影響，同時也不利于民生的發展。國家采用金融調控的方式對房地產行業進行調控，穩定房地產行業的發展。金融調控對于房地產行業和金融行業都有著重要的影響，國家應該充分重視金融調控手段的使用，發揮出應有的作用，更好地促進國家經濟的發展。

一、當前我國房地產金融調控的政策

隨著房價的不斷上漲，國家采用一系列政策對房價進行有效的調控，穩定房地產行業的發展。金融調控政策是比較常見的調控政策，對于穩定國家經濟的發展有著十分重要的作用。金融調控主要是指國家運用經濟法律和行政手段對國家的金融市場進行調節，保障金融體系的穩定運行，穩定物價和國際收支平衡。

當前我國為了更好地抑制房地產行業發展過快，采取了一系列的金融調控政策穩定經濟的發展。當前銀行的信貸資金漸漸收緊，銀行的信貸門檻逐漸增加，這在一定程度上減少了銀行貸款，降低了房地產行業的熱度。近年來國家逐漸控制買房的銀行貸款，對首付的貸款進行嚴格的限制。同時國家又出臺了限購政策，一方面維護市民的利益，另一方面穩定房地產市場的發展。國家采用緊縮性的金融政策維護房地產行業的發展，保持國家經濟發展的健康趨勢，對于人民生活的穩定和國家的穩定有著十分重要的作用。

二、房地產金融調控對于房地產行業的影響

當前國家對于房地產市場的發展進行了嚴格的管理和限制，對房地產行業進行規劃，維護房地產行業的健康發展有著十分重要的作用。隨著國家經濟的發展，房地產行業的發展速度過快這不僅不利于房地產市場的長遠發展，同時也會影響人民群眾的正常生活。國家采用金融政策對房地產行業進行調控對房地產行業的發展主要有以下幾個方面的影響：

（一）降低房地產行業發展的風險

近年來房地產行業發展速度過快，房價逐漸升高，不僅給人們的生活造成了影響，同時也對國家經濟的發展構成了一定的威脅。國家采用緊縮性的金融政策對房地產行業進行調整在一定程度上可以有效地降低房地產行業發展的風險。房地產行業發展過快，銀行貸款逐漸增加，如果房價過高不能及時售出將會引發金融危機，影響房地產行業的發展和國家的經濟建設。但是國家采用政策控制房地產行業的銀行貸款可以有效降低風險，穩定房地產行業的發展。

（二）規范房地產行業的發展

當前房地產行業的發展競爭十分激烈，房地產行業的發展缺少相應的規范，這對于房地產行業的長遠發展有著十分不利的影響。加強房地產行業的金融調控可以有效地規范房地產行業的發展。對房地產行業的規模進行有效的控制，對一些不合理的房地產企業進行有效的調整和規劃，促進房地產企業的良性健康發展，穩定房地產市場。

三、房地產金融調控對于金融行業的影響

金融調控作為國家調控政策的主要手段之一，對于穩定國家的經濟發展有著十分關鍵的作用。金融調控政策對于調控房地產行業的發展有著重要的作用，同時對于金融行業的發展也有著十分重要的作用。

（一）有利于防范金融風險

隨著國家銀行貸款業務的發展，商業銀行在房地產行業中占據著十分重要的位置，商業銀行基本上參與了房地產開發的全過程。金融調控政策可以有效地降低房地產行業的貸款金額，對于降低貸款風險，維護商業銀行的利益有著重要的作用。這在一定程度上可以降低金融風險，保障市場經濟的發展。

（二）有利于促進商業銀行的結構調整

國家采用緊縮性的金融政策降低房地產行業的貸款數額，對于商業銀行的影響是很大的，商業銀行的貸款業務減少，在一定程度上影響了商業銀行的經濟效益。商業銀行為了維護銀行的利益會考慮開展多種銀行業務，保障商業銀行的發展。這對于商業銀行的業務結構調整，促進商業銀行的發展有著重要的促進作用。

四、結語

我國的房地產行業對于國家的經濟建設做出了重要的貢獻，房地產行業也取得了較好的經濟效益。當前房地產行業的規模逐漸擴大，房地產行業的競爭也逐漸激烈，但是房地產行業為了擴大規模，貸款數額逐漸增加，這對于國家的經濟發展和銀行的發展造成了一定的威脅。國家應該積極利用金融政策對房地產行業進行相應的調整，保障房地產行業的健康發展。房地產金融調控政策是國家調整房地產行業發展采用的主要措施，金融調控政策對于房地產行業的發展和金融行業的發展都有著十分積極的作用。今后房地產行業的發展還需要國家金融政策的進一步調整和鞏固，維護市場經濟的健康發展。

參考文獻

[1]劉櫻.中國房地產行業融資問題及對策研究[J].時代金融，2006（07）.

雙向調控范文第2篇

據媒體披露，從4月底開始，天津陸續有濱海新區差別化限購和天津放開三套住房限購的傳聞傳出。根據中原地產研究部統計數據顯示，截至5月20日，已出臺及傳聞將出臺救市措施的城市超過10個，其中明確出臺救市措施的城市包括南寧、無錫、寧波、溫州、徐州等。

盡管已是初夏，但中國樓市的“倒春寒”卻愈演愈烈。雖然住建部尚未公開表態，但各地政府或明或暗的救市措施，正在從傳言變成事實，輿論對此褒貶不一。而在“雙向調控”的背景下，地方政府或將取代中央政府成為今后房地產的調控主體。

房價“滯漲”，各地救市

5月下旬，在寧波舉辦的2014年杭州灣論壇上，瑞銀證券中國證券研究主管侯延琨表示，中國的房價不會大幅下跌，但他認為目前的狀態非常糟糕。“現在中國的房地產庫存和銷售量比已經到了2008年以來最糟糕的階段，”他談道，“最根本的問題是新開工面積下滑。假如這一數據無法恢復的話，（受此拖累）明年GDP增速跌破5%是非常有可能的。”

據國家統計局公布的數據，今年一季度，房屋新開工面積2.9億平方米，同比下降25.2 %。《中國經濟周刊》記者查閱各地統計局數據發現，一季度廣東此數據同比下降35.0%；前4個月云南同比下降41.0%；而在河南平頂山市，今年1―4月份，商品房開工面積同比減少60.9%。

各地新開工面積的急劇下滑，顯示出開發商的擔憂，而房地產行業的低迷直接體現在房價上――5月18日國家統計局公布的4月70個大中城市房價指數顯示，新建商品住宅價格環比上漲的城市為44個，較3月減少12個，創下2012年11月至今的最低值。從環比漲幅中位數看，新建商品住宅價格環比漲幅為0.1%，房價已經進入“滯漲”狀態。

在土地市場，也同樣表現出低迷狀態。21世紀不動產向《中國經濟周刊》提供的一份資料顯示，截至5月26日，隨著浦東新場商住用地和寶山羅店商業用地出讓時間延后，上海5月經營性土地市場交易已經落下帷幕，整月僅有兩塊經營性土地出讓，創2012年3月至今的最低值，合計出讓面積3.5萬平方米、出讓金額32.4億元，環比分別下滑90.2%和50.9%，同比則分別下滑91.9%和81%。

“5月土地市場遇冷的主要原因在于近期上海土地供應收縮，開發商顯得更為謹慎理性。”21世紀不動產上海區域市場研究部副總監黃河滔分析稱。

在經濟下行的壓力下，市場傳聞的地方政府救市政策出臺，不難理解。5月下旬，數家媒體引述住建部人士非正式表態稱：“除北上廣深之外，其他城市的限購政策可以自行調節，尤其是庫存過大的地方，但不會明確發文。”住建部傳達的調控方向是，希望市場能自我調整。但在房產稅、遺產稅等經濟手段沒有出臺之前，一些中心城市的部分行政調控手段不能退出。

至本文截稿時，住建部尚未對上述消息做出正式回應。“如果上述消息屬實，意味著非一線城市或將全面松綁限購政策。”黃河滔認為，“近期二三線城市紛紛出臺救市政策，其中不乏或明或暗松綁限購政策，如果中央政府不喊停，限購政策或將分城、分階段逐級淡出。”

政府是否該救市？輿論現分歧

面對樓價的下跌，各地政府是否應該救市？

在2014年杭州灣論壇上，2013年諾獎得主、耶魯大學教授羅伯特?席勒（Robert Shiller）給出了肯定的答案。他認為“盡管中國房地產市場目前處于大幅的波動，但是這并不代表世界末日，只要政府讓市場盡可能地穩定，在合理的干預下能夠保證市場穩定就沒有問題”。

在同一場合與席勒對話時，侯延琨認為，“各地政府最近出臺救市措施，是一個非常合適的時機，但政府的刺激是不是能夠有效托底，卻讓人懷疑。”

房地產專家韓世同也認為政府此時該救市，他說，如需要救市，應該先做基本判斷：現在是否已經有房價暴跌甚至崩盤的危險，從而影響經濟、金融安危？一種答案是肯定的，一種答案是否定的，如果認為未來不可能出現崩盤、泡沫破碎的危機，就不需做任何動作。“這個基本判斷中，我傾向于前者，（政府）現在就必然要采取措施。”他對《中國經濟周刊》記者說。

在接受《中國經濟周刊》專訪時，上海財經大學陳杰教授的觀點卻截然相反。他認為地方政府不僅不應該救市，而且目前救市的時機也完全不當。他認為目前經濟還沒有惡化到需要救市的程度，政府應該給市場一個長期的穩定預期，如果政府都是隨行就市，市場參與者難有長遠預期，經濟就難以穩定發展。

“政府人為地用短期化的手段去調節市場，其實像打激素。政府不應當改變市場機制，而應該讓市場自我調整。”陳杰說，“應該順應市場本身的規律，不管投資者是個人也好，開發商也好，如果決策失誤，就應該受到市場的懲罰。”

“雙向調控”促地方政府成調控主體

對于房地產調控，政府將如何作為？今年“兩會”期間，住建部部長姜偉新在回答記者提問時拋出了“雙向調控”的理念，這與“分類調控”一起成為今年地產界的熱詞。

此后，住建部副部長齊驥就“雙向調控”做出了解釋：所謂雙向調控亦可稱分類指導，即對一線城市繼續增加供應，抑制投機性需求，限購政策不退出；而對于庫存量比較大的城市，要控制供地結構。

此番各地政府的救市之舉似乎正回應了上述兩個熱詞。黃河滔認為，在此政策背景下，中央和地方在調控中所扮演的角色也正在發生轉換。

雙向調控范文第3篇

【關鍵詞】電子商務 經濟增長 協調發展 控制模式

一、電子商務復雜大系統的特征

（一）復雜大系統的特征

從現代經濟發展的大趨勢來看，復雜大系統具有開放性、層次性、動態性、復雜性特征。一般來說，復雜大系統都是有人、機、環境三大要素來構成的，要素之間的溝通需要借助環境所賦予的各項參數進行，因此社會經濟系統必須是一個開放性的系統，否則其會失去生命力。構成復雜大系統的要素通常是許多小系統，這些小系統在獨立發揮作用時是呈現層次性的，這也體現了復雜大系統的層次性。社會經濟是不斷發展變化的，這也使得復雜大系統的穩定狀態是動態的，社會經濟因素的變動帶動系統的變動。復雜性則可分為三個層次，即物理層的復雜性、生物層的復雜性、社會經濟層的復雜性。

（二）電子商務的大系統特征

電子商務的大系統是社會經濟復雜大系統的重要組成部分，可視作是其子系統，因此電子商務的大系統除具備復雜大系統的主要特征之外，還具有電子商務系統的特征。電子商務的大系統是開放狀態的，它面向的是所有企業與個人，在開放的環境中完成物質交換與信息交換。系統通常包含若干個子系統，這是由其商務活動的性質決定的，比如企業投入的資源、各職能部門等。系統的子系統種類繁多且復雜，由于電子商務大系統具有開放性特征，這使得構成或參與電子商務活動的要素很多，每個要素都可能成為一個子系統，這造成了子系統的種類繁多且具有復雜性特征。

二、電子商務與經濟增長協調發展控制理論與方式

（一）電子商務協調發展的大系統遞階結構

電子商務系統是社會經濟大系統的子系統，因此其可按照大系統的多層遞階結構思想來建立多層管理模式，即將電子商務系統按照構成要素分成相互獨立的多個子系統，每個子系統相互關聯，通過統計指標分析可建立三層結構的遞階結構系統：局部控制級（直接控制層，最低決策級）、遞階控制級（最優化層、中間決策級）、協調控制層（自適應層，最高決策級）。根據國民經濟控制原理，這種三層結構的電子商務遞階結構系統更有利于實現國民經濟的協調控制，促進產業組織結構的優化，改善企業經營管理。遞階結構的電子商務系統體現較強的雙向控制特征，即電子商務與經濟增長的雙向控制。

（二）電子商務與經濟增長間的協調發展指數模型

要研究電子商務對經濟增長的協調控制評價，需要建立電子商務與經濟增長的協調控制指數模型，該模型需要滿足兩個要素，即協調度與發展量。首先，根據電子商務與經濟發展的特征與相互關聯，建立電子商務與經濟增長的協調發展評價指數，并對該指數進行無量綱處理，使該模型能夠實現量化分析；其次，據大系統的協調原則，即關聯預估原理，計算每個指標的狀態變量指標的協調變量，并對無量綱指標進行標準化處理，并進行加權加法，最終得到協調發展指數模型：

（三）電子商務協調控制模型

在研究電子商務與經濟增長的協調控制時，可將電子商務視作一個大系統，將其構成要素視為其的子系統，那么從電子商務與經濟增長的實際出發，通過分析電子商務大系統的各個子系統模型，并在內在關聯的作用下生成整體的模型結構。即：

從模型的構建來看，其計算過程如下：①收集研究對象的資料，并根據構建模型的需求統計單個指標；②根據上述模型計算時變參數θij（k）；③在確定好各項參數后，結合實際情況采取最為合理的方法對參數進行估計與預測；④采用狀態方程的自適應預測與控制；⑤進行電子商務大系統的自適應協調控制。

三、電子商務與經濟增長協調發展及雙向控制

（一）電子商務―經濟增長協調發展控制

要想分析電子商務―經濟增長協調發展，必須設計出電子商務系統控制指標與經濟系統控制的指標，然后計算協調度指標。電子商務―經濟增長協調發展控制指標體系主要包括信息資源開發效率指標、信息資源投入效率指標、信息資源利用效率指標、協調度指標。協調度指標主要包括管理運行協調度、企業文化適宜度。將所有指標明確后，經過無量綱化處理，即可實現對電子商務―經濟增長協調發展控制的評價。

（二）企業電子商務協調發展評價

企業電子商務協調發展評價既是將電子商務大系統所有指標進行加權量化，一般采用多級模糊綜合評價方法進行。涉及評價的指標主要包括內生信息資源產出率、外生信息資源產出率、電子商務收益率、電子商務銷售收益率、信息基礎設備使用率、電子商務需求效率、電子商務應用效率、電子商務利用率、專利成果利用率、電子商務人員業績、電子商務系統運行調度、企業文化適宜度、管理運行協調度等。對所有指標因素進行量化加權后，通過綜合分析，可實現電子商務經濟協調發展評價。

（三）電子商務與經濟增長的協調控制思路

電子商務與經濟增長之間的關聯程度可直觀的反應企業經濟活動水平，電子商務系統質量則決定了電子商務系統的運行效率與經濟效益，因此在進行電子商務與經濟增長協調控制時，應考慮電子商務系統控制的目標，即提高區域經濟系統的電子商務資源配置效率，提高經濟增長層次。

參考文獻

[1]楊哲.電子商務對經濟增長貢獻的評價與控制研究[J].商場現代化.2014.10.

雙向調控范文第4篇

1.1半定量RT-PCR檢測VEGF的表達提取RNA方法如下：將50mL細胞培養瓶中細胞達到80%融合時，倒掉培養液，加入1mLTrizol。將培養瓶內Trizol吸取至1mLEP管中，室溫靜置5min。加入200μL氯仿，劇烈搖晃數次，室溫靜置5min，11000轉/分，4℃離心15min。取上清液加入新1mLEP管中，加入500μL異丙醇后搖晃數次。室溫靜置10min，11000轉/分，4℃離心10min。棄上清液加1mL75%乙醇后混勻。7500轉/分，4℃離心5min。棄上清液風干，加入20μL無RNA酶水，58℃加溫10min，-70℃凍存。將mRNA逆轉錄成cDNA，50μL反應體系PCR反應。VEGF（682bp）引物序列：5''''ggctctagatcgggcctccgaaaccat3''''和5''''ggctctagagcgcagagtctcctcttc3'''';β-actin（434bp）引物序列：5''''tgtgcccatctacgaggggtatgc3''''和5''''ggtacatggtggtgccgccagaca3''''。反應條件：95°C變性，30s；VEGF63.5°C退火，27循環，45s；或β-actin57°C退火，25循環，30s；72°C延伸30s。收集PCR產物1.5%瓊脂糖電泳。凝膠成像系統半定量分析。以上結果均重復3次。

1.2統計學處理采用SPSS11.5統計軟件進行統計處理，計量指標用（x軃±s）表示，ANOVA方差分析，student-Newman-Keuls檢驗，方差齊性檢驗進行顯著性檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1細胞毒性活力檢測ACC-M和ACC-2細胞在不同濃度的SNAP作用4h后細胞的活力，在0μmol/L~500μmol/L濃度的SNAP作用下，細胞的活力均保持在88%以上（表1）。經濃度100ng/mL的LPS預刺激12h后，用500μmol/L的SNAP分別作用不同時間ACC-M和ACC-2細胞活力，其活力均保持在86%以上。

2.2不同濃度SNAP對ACCs細胞中VEGF的mRNA表達水平的影響半定量RT－PCR的結果表明（圖1、圖2），在31.25μmol/LSNAP刺激下ACC-M和ACC-2細胞中VEGF的mRNA平均水平顯著升高，為2.32±0.10和2.14±0.15，分別是對照組細胞（0μmol/L）mRNA水平的4.14倍和6.90倍，差異有統計學意（P<0.01）。隨著SNAP刺激濃度升高，mR－NA水平逐漸回落：62.5μmol/LSNAP仍可明顯上調VEGF的mRNA水平（P<0.01），但不及31.25μmol/L的SNAP顯著；125μmol/L和250μmol/LSNAP對VEGFmRNA影響差異無統計學意義；而500μmol/LSNAP則顯著下調ACCs細胞中VEGF的mRNA水平（P<0.01），僅為基礎mRNA水平的0.23倍和0.17倍（表3）。One－WayANOVA檢驗和Student–Newman-Keuls檢驗比較31.25μmol/L、62.5μmol/L及500μmol/L濃度組與0對照組mRNA表達差異有統計學意義。

2.3SNAP時間依賴性抑制100ng/mLLPS誘導的VEGF的表達水平隨著500μmol/LSNAP作用時間的延長，ACCs細胞中LPS誘導的VEGFmRNA水平顯著下降（P<0.01）；當500μmol/LSNAP作用4h后，僅可檢測到極微弱的VEGFmRNA條帶，其mRNA的平均表達水平顯著低于LPS誘導12h后SNAP作用0小時組的mRNA水平（表4）。半定量RT－PCR的結果（見圖3、圖4）。One－WayANOVA檢驗和Student-Newman-Keuls檢驗比較其他各時間組與0對照組mRNA表達差異有統計學意義（P<0.05）。

3討論

一氧化氮（NO）是一種極不穩定的生物自由基，其生成依賴于細胞內的一氧化氮合成酶（nitricoxidesynthaseenzyme，NOS）。它能通過傳遞電子的反應參與機體的氧化還原反應，在生物體內發揮重要生理作用。目前越來越多的研究證實，NO在腫瘤細胞中發揮著雙向調節的作用。研究發現，腫瘤微血管內皮細胞和腫瘤基質細胞中NOS的高表達，能抑制腫瘤的生長和局部浸潤。而另一些研究表明，NO具有促進腫瘤血管發生和局部侵襲性。不同的NO濃度是其在腫瘤調控中發揮著截然相反作用的主要原因。高濃度的NO在生物體內形成過氧亞硝基（OONO-）和N3O2，能氧化或硝化DNA導致DNA單鏈斷裂、抑制DNA的合成以及核苷酸還原酶的活性，并能抑制體內的磷酸化信號通路的活化促進腫瘤細胞的凋亡。而低濃度的NO被證實與腫瘤微血管發生、腫瘤浸潤和轉移相關。因此將NO作為腫瘤治療的重要手段的同時，應充分認識低濃度的NO對腫瘤促進作用。本實驗證明NO的供體SNAP對ACCs細胞有著雙向調控作用，當SNAP的刺激濃度在31.25μmol/L時能顯著上調血管發生相關因子的表達，而當SNAP的刺激濃度在500μmol/L時血管發生相關因子的表達被有效抑制。

大量研究證明，NO誘導的血管發生相關因子的異常表達，在促進腫瘤微血管發生方面發揮著重要的作用。Jenkins等[8]首次報道在人腫瘤細胞中，轉入iNOScDNA閱讀框后腫瘤生長加速，且伴隨著大量微血管的發生。Ambs等的實驗證實，在異種種植瘤內NO能誘導VEGF表達增高，促進腫瘤微血管發生。可見在ACC中，相對低濃度的NO可能通過上調VEGF表達來促進腫瘤微血管發生。

雙向調控范文第5篇

【關鍵詞】 PTEN 雙向電泳 基質輔助激光解 電離飛行時間質譜 肽質量指紋圖譜

ABSTRACT: Objective To study protein variation between PtenL/LMEFs and Pten/MEFs cells. Methods Twodimensional electrophoresis (2DE) was employed to compare the differential expression proteins between PtenL/LMEFs and Pten/MEFs cells. Six differential expression proteins were digested in gel by enzyme and the mass of generated peptides was measured by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDITOFMS). The data obtained from peptide mass fingerprinting (PMF) were searched using the Internet available database and five proteins were identified. Results Compared with that of PtenL/LMEFs， expression level of proteins including phosphoglycerate mutase 1 (PGAM1) and peptidylprolyl cistrans isomerase C (PPIC) was upregulated， whereas expression level of Transgelin 2 was downregulated in Pten/MEFs cells. B and F proteins were both identified to be peroxiredoxin6. They had similar molecular weight but different PI which might be caused by posttranslation modification. B protein was only expressed in Pten/MEFs cells. Conclusion The protein profile of Pten/MEFs cells displayed obvious difference compared to that of PtenL/LMEFs cells. The results implied that various distinct different proteins might lead to cancer.

KEY WORDS: PTEN; twodimensional electrophoresis (2DE); matrix assisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry; peptide mass fingerprinting

第10號染色體同源缺失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten， PTEN)是第一個被發現的其產物具有磷酸酶活性的抑癌基因，它通過負調控多種信號轉導途徑包括PI3K/Akt途徑、FAK途徑和MAPK途徑調節細胞生長、增殖、生存及轉移。研究發現PTEN在多種腫瘤中存在缺失或突變 [12]。培育PTEN基因敲除小鼠及細胞系是研究PTEN基因功能的最重要的手段。永生化的小鼠胚胎成纖維細胞系PtenL/LMEFs細胞和PTEN基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞系Pten/MEFs是研究PTEN功能的理想體外細胞模型。Pten/MEFs細胞的建系方法：首先培育并永生化來自PtenloxP/loxP小鼠的胚胎成纖維細胞(PtenL/LMEFs細胞)，此小鼠的Pten基因的外顯子5兩旁各插入一段loxP序列，但Pten的轉錄不受影響，因此PtenL/LMEFs細胞可作為Pten表達正常的對照細胞；此細胞系在體外條件下被瞬時轉染Cre重組酶，Cre重組酶可識別并剪切由loxP序列所標記的序列，經過篩選而獲得Pten缺失的細胞系Pten/MEFs[3]。Freeman等[3]利用以上細胞系研究了PTEN對p53的作用，提出了PTEN同p53相互作用的新機制：PTEN可同p53直接物理性結合，影響p53結合DNA的能力，調控p53的轉錄活力。Chang等[4]利用以上細胞系的研究發現PTEN通過Mdm2的P1啟動子調節Mdm2的表達。Li等[5]利用以上細胞系的研究發現一種分泌性的生長因子Pleiotrophin在PTEN缺失后表達上調，抑制該蛋白的表達后PTEN缺失細胞的生長和致瘤能力降低。為了更好地了解PTEN調控細胞功能的機制，本研究應用蛋白質組技術比較了PtenL/LMEFs與Pten/MEFs細胞系的蛋白質表達譜，鑒定出一些差異表達的蛋白，為闡明PTEN調控細胞功能的機制提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料 PtenL/LMEFs細胞系和Pten/MEFs細胞系由美國加州大學洛杉基分校Hong Wu博士饋贈，本實驗室保存；IPG干膠條(pH 3-10，18cm)，蛋白定量試劑盒(2D Quant Kit)購自Amersham Pharmacia公司；蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor cocktail tablet)購自Roche公司；低分子量標準購自Promega公司；Trisbase購自Sigma公司；PTEN/AKT信號轉導通路檢測試劑盒購自Cell Signaling公司(含磷酸化PTEN多克隆抗體、AKT多克隆抗體、磷酸化AKT473多克隆抗體、磷酸化AKT308多克隆抗體、磷酸化GSK3β多克隆抗體，均為兔抗小鼠的多克隆抗體)；山羊抗小鼠PTEN多克隆抗體、熒光顯色試劑購自Santa cruz公司，HRP標記的兔抗山羊多克隆抗體購自中山生物試劑公司；PVDF膜購自Biorad公司；等電聚焦儀為EttanTM IPGphorTM(Amersham Pharmacia)；垂直板電泳儀為Protean Ⅱ Xi(BioRad，美國)；質譜儀為Reflex Ⅲ MALDITOF MS(Bruker)。

1.2 細胞培養和蛋白樣品制備 PtenL/LMEFs和Pten/MEFs細胞按常規方法培養，用含100mL/L胎牛血清，終濃度為100u/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養液，置于37℃、50mL/L CO2培養箱中恒溫恒濕培養；當細胞達到指數增長期后，胰酶消化細胞并用PBS緩沖液洗滌3遍；1×107個細胞中加入100μL的裂解緩沖液(8mol/L尿素，40g/L CHAPS，40mmol/L Trisbase)并加入蛋白酶抑制劑，用超聲儀超聲裂解細胞；加入10μL RNA酶(10μg/μL)，4℃放置30min，4℃ 12000r/min離心15min去除不溶性沉淀；取上清用蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度，按照每管1mg分裝，-70℃保存備用。

1.3 雙向電泳 參照文獻[7]進行。分別在1mg PtenL/LMEFs和Pten/MEFs細胞蛋白樣品中加入溶漲液(8mol/L尿素，20g/L CHAPS，體積分數為0.5% pH 3-10 IPG緩沖液，20mmol/L DTT和極少量的溴酚藍)定容至350μL，充分混勻。用18cm IPG膠條(pH 3-10)于20℃在IPGphor(Amersham Pharmacia Biotech)上等電聚焦(每個膠條在30V電壓下聚焦6h，500V電壓下聚焦1h，1000V電壓下聚焦1h，8000V電壓下聚焦5h，每個膠條電流不超過50μA)。膠條經2次平衡后，在垂直膠電泳系統(BioRad protean Ⅱ Xi， BioRad laboratories)上用125g/L的SDSPAGE進行雙向分離。電泳完成后，用考馬斯亮藍G250染色液過夜染色，用10mL/L冰乙酸脫色。

1.4 圖像掃描和分析 用ImageScanner掃描儀掃描，用PDQUEST 7.0軟件進行圖像分析。

1.5 膠內酶切 切取膠上的蛋白質點，用50μL脫色液(25mmol/L碳酸氫氨+體積分數為50%乙腈)于室溫脫色至膠塊無色。真空離心后加入2μL溶于20mmol/L碳酸氫氨的胰蛋白酶(10ng/μL，Roche測序級)，4℃吸漲1h后37℃作用10-12h。加入8μL體積分數為5%三氟乙酸，37℃溫育1h，將液體吸凈，移至干凈的離心管中。再加入8μL溶液(體積分數為2.5%三氟乙酸+體積分數為50%乙腈)，30℃溫育1h，吸出液體，與前一次的抽提物合并。真空離心干燥肽段提取液，用2μL溶液(體積分數為0.5%三氟乙酸+體積分數為30%乙腈)充分溶解肽段，進行質譜鑒定。

1.6 MALDITOF質譜鑒定及數據庫檢索 基質為溶于體積分數為0.1%三氟乙酸/體積分數為50%乙腈的飽和α氰基4羥基肉桂酸，利用Reflex Ⅲ MALDITOF MS質譜儀(Bruker)在加速電壓為20kV，反射電壓為23kV的條件下進行MALDITOF MS測定。質譜數據利用Bruker的標準肽段或胰蛋白酶自裂解片段進行校正。將質譜所測肽質量指紋圖譜數據輸入互聯網上的Mascot數據庫(matrixscience.com)進行檢索。檢索時，物種選擇小鼠，可接受的肽段相對分子質量誤差為0.4ku，固定修飾方式(fixed modifications)選擇Carbamidomethyl(C)，可變的氨基酸修飾方式(Variable modifications)選擇Oxidation(M)，Max missed cleavage為1，最少匹配肽段4個。分值大于54為檢索結果具有統計學意義(P

1.7 Western印跡 提取細胞總蛋白質，取100μg上樣行100g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜。50g/L脫脂奶粉室溫封閉膜2h，一抗4℃孵育過夜。所用一抗分別是：PTEN多克隆抗體、磷酸化PTEN多克隆抗體、AKT多克隆抗體、磷酸化AKT473(PAKT473)多克隆抗體、磷酸化AKT308(PAKT308)多克隆抗體、磷酸化GSK3β多克隆抗體。用HRP標記的第二抗體室溫孵育2h后，發光底物顯跡法進行顯跡，經顯影、定影后分析雜交信號，并以同一張膜上重復雜交β肌動蛋白(ACTIN)作為對照。

2 結果

2.1 Western blot檢測結果 Western blot檢測證實PTEN在PtenL/LMEFs中表達水平較高且有磷酸化的PTEN(PPTEN)存在而在Pten/MEFs細胞中檢測不到PTEN和PPTEN蛋白(圖1)，表明細胞系PtenL/LMEFs正常表達PTEN蛋白，而Pten/MEFs細胞PTEN蛋白表達缺失。PTEN/AKT信號轉導通路中關鍵分子的蛋白表達檢測發現：PTEN缺失后細胞內AKT在473位和308位的磷酸化水平均顯著增加，GSK3β磷酸化水平增加(圖2)。

圖1 Western blot 檢測PtenL/LMEFs和Pten/MEFs細胞中PTEN和PPTEN蛋白的表達（略）

Fig.1 Expression of PTEN and PPTEN in PtenL/LMEFs and Pten/ MEFs cells

2.2 PtenL/LMEFs和Pten/MEFs細胞的蛋白質雙向電泳圖譜分析 PtenL/LMEFs和Pten/MEFs細胞總蛋白質雙向凝膠電泳重復3次，代表性圖譜如圖3和圖4所示。用PDQUEST 8.0.1軟件分析蛋白圖譜。每張電泳圖顯示約900個蛋白點。對差異表達的蛋白點A、B、C、D、E和F(圖3、圖4)進行質譜鑒定。

圖2 Western blot 檢測PtenL/LMEFs和Pten/MEFs細胞中PTEN/AKT信號轉導通路中關鍵蛋白的表達（略）

Fig.2 Expression of key moleculors of PTEN/AKT signal transduction pathway in PtenL/LMEFs and Pten/MEFs cells

2.3 雙向凝膠差異蛋白點的肽質量指紋譜鑒定 對差異表達的蛋白點A、B、C、D、E和F進行MALDITOFMS測定肽質量指紋譜。通過Mascot搜尋軟件直接上網(matrixscience.com)進行搜尋，查詢結果見表1。除D蛋白由于檢測分值(protein score)小于54，其余的蛋白檢測結果都有意義。

圖3 PtenL/LMEFs(A)和Pten/MEFs(B)細胞的2DE雙向凝膠圖譜（略）

Fig.3 Twodimensional electrophoretic (2DE) maps of PtenL/LMEFs(A) and Pten/ MEFs(B) cells

圖4 PtenL/LMEFs和Pten/MEFs細胞的雙向電泳凝膠的局部圖，箭頭所指的蛋白在兩個細胞中差異表達（略）

Fig.4 Segments of twodimensional gels of PtenL/LMEFs and Pten/MEFs cells. Arrowed are six protein spots that are differentially expressed

表1 PtenL/LMEFs和Pten/MEFs細胞中6個差異表達蛋白進行質譜鑒定，通過在SWISSPROT 數據庫中檢索肽質量指紋圖譜數據，5個蛋白得到鑒定（略）

Table 1 Six differentially expressed proteins in PtenL/LMEFs and Pten/MEFs cells were analyzed with MALDITOF MS and five proteins were identified by PMF searching in SWISSPROT database

*Protein score is -10×Log(P)， where P is the probability that the observed match is a random event; Protein scores greater than 54 are significant (P

3 討論

PTEN蛋白是雙重底物特異性磷酸酶，具有脂磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性。PTEN蛋白主要通過它的脂質磷酸酶活性對PI3K途徑起著負調控的作用。PTEN缺失導致3，4，5，三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)水平上升，PIP3的聚集引起各種蛋白激酶的活化，包括PDK1和PKB/AKT絲/蘇氨酸激酶。AKT是PTEN調控途徑中的關鍵分子，AKT的絲氨酸-473和蘇氨酸-308位點磷酸化后使AKT激活，參與細胞的轉錄、翻譯，抵抗凋亡。PI3K/AKT是重要的信號通路，AKT能夠通過磷酸化它的底物從而導致細胞周期進程的加速、促進細胞生長、存活、遷移、血管生成、蛋白合成和糖原代謝等[6]。PTEN蛋白是脂質磷酸酶，能使PIP3脫磷酸，阻斷PI3K/AKT通路。如果PTEN蛋白失活，PI3K/AKT持續活化，將導致細胞分裂、體積增大、凋亡阻滯和腫瘤血管生成等[7]。本研究發現PTEN缺失細胞Pten/MEFs中AKT蛋白在其473位和308位的磷酸化水平明顯升高，說明PTEN的缺失導致AKT的激活(圖1、圖2)。GSK3β是AKT調控的重要底物之一。研究發現GSK3β的磷酸化水平在PTEN缺失后水平升高(圖2)。GSK3β被AKT磷酸化后，其活性受到抑制，將導致Cyclin D1上GSK3β作用位點的磷酸化程度降低，進而阻滯Cyclin D1的蛋白降解，促進細胞增殖[8]。

本研究應用蛋白質組技術比較了PtenL/LMEFs與Pten/MEFs細胞系的蛋白質表達譜，PtenL/LMEFs與Pten/MEFs細胞系的電泳圖各顯示約900個蛋白點(圖3)。質譜鑒定了差異表達的蛋白中的6個蛋白，經數據庫的檢索5個蛋白點得到確認，它們分別是磷酸甘油酸變位酶1(phosphoglycerate mutase 1， PGAM1)、肽脯氨酰順反異構酶C(peptidylprolyl cistrans isomerase C， cyclophilin C)、Transgelin 2和過氧化物氧化還原酶6(Peroxiredoxin6)蛋白，其中蛋白點B和F經檢索得知它們都是過氧化物氧化還原酶6(表1)。

小鼠的肽脯氨酰順反異構酶C 即Cyclophilin C屬于Cyclophilin家族。Cyclophilin (CyP)即環孢素A結合蛋白，是環孢素A(CyclosporinA，CsA)的細胞內蛋白受體。Mi等[9]發現Osteopontin的COOH(-)末端片段與另一細胞轉移功能的標志蛋白Cyclophilin C作用并結合到CD147細胞表面糖蛋白上，從而激活AKT1/2和基質金屬蛋白酶2。體外分析實驗中，在Cyclophilin C存在時Osteopontin的COOH(-)末端片段促進4T07和4T1細胞的遷移和浸潤。Nabeshima等[10]報道Cyclophilin(A，B，C，D)的過表達及其與CD147蛋白的相互作用與胰腺癌、乳腺癌及非小細胞肺癌細胞的增殖、轉移能力的增強有關。這些實驗結果表明Cyclophilin C在細胞內發揮著重要的作用。Cyclophilin C在Pten/MEFs細胞表達上調，它在PTEN缺失后的細胞中的功能還有待進一步的研究。

小鼠Transgelin 2與SM22β基因都編碼同一個199個氨基酸的蛋白，分子質量約為22.4ku，小鼠SM22β與小鼠SM22α蛋白的氨基酸序列有68%的同源性。在平滑肌細胞中小鼠SM22β與小鼠SM22α蛋白共定位于actin肌絲蛋白上[11]。含有突變的SM22α基因的小鼠其含有平滑肌細胞的組織及動脈、靜脈的組織學或超微結構沒有明顯的改變，說明在平滑肌細胞中可能存在與SM22α一起表達的其他蛋白可能能夠代替其基本的功能，SM22β可能就是該類蛋白[1112]。Gabr等報道大鼠氣管內滴入肝素后24h將引起DJ1/PARK7蛋白的顯著上調和Transgelin 2(TAGLN2)顯著下調。DJ1/PARK7蛋白是PTEN蛋白的負調控蛋白，也是腫瘤潛在的標志物[13]。這提示PTEN的抑制與Transgelin 2(TAGLN2)的下調可能有關。Transgelin 2在Pten/MEFs細胞表達下調，Transgelin 2同PTEN的關系及其在腫瘤發生中的作用值得深入研究。

PGAM1是一種參與糖酵解的酶，可能在腫瘤細胞的代謝和增殖中起作用。最近的研究表明，腫瘤細胞的生存有賴于糖酵解途徑，PGAM1 可作為潛在的腫瘤治療的新靶點 [14]。Chen等[15]報道PGAM1在肺腺癌組織中高表達且與不良預后有關。PGAM1在Pten/MEFs細胞表達上調，它在PTEN缺失后細胞的代謝和增殖中的作用值得進一步研究。

Peroxiredoxin6蛋白是一種抗氧化蛋白，起細胞保護作用。在Pten/MEFs細胞中表達的兩個蛋白點B和F經質譜鑒定和數據庫檢索發現它們都是Peroxiredoxin6蛋白，B點在PtenL/LMEFs細胞中檢測不到(圖3、圖4)，提示Peroxiredoxin6蛋白在Pten/MEFs細胞中可能發生了翻譯后修飾，其意義值得研究。

通過比較蛋白質組學的研究，我們發現PTEN缺失的小鼠胚胎細胞系Pten/MEFs細胞與PTEN表達正常的對照小鼠胚胎細胞系PtenL/LMEFs細胞在蛋白表達水平上存在明顯差異。已經鑒定的差異性蛋白質涉及細胞的代謝、氧化應激、侵襲轉移、信號傳導等細胞生物學過程。進一步研究它們在PTEN缺失后細胞癌變過程中的作用，這對深入闡明腫瘤發生機理及尋求抗腫瘤新靶點具有重要意義。

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