高效液相色譜
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高效液相色譜范文第1篇
[中圖分類號] R927[文獻標識碼]A [文章編號]1673-7210（2008）08（a）-028-02
Generality of HPLC
ZHANG Jian-hong,CHEN You-sheng
(Department of Pharmacy, Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou 510520，China)
[Abstract] This paper summarizes the advantages, disadvantages, types, applications and foreground of HPLC
[Key words] HPLC; Advantage;Application;Disadvantage;Foreground
高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)是利用高壓輸液泵驅使流動相通過裝填固定相的色譜柱，按照固液相之間的分配機制對混合物進行分離的方法。
1高效液相色譜法具有的優點
與其他譜法相比具有以下優點：①高分離率(應用10 μm以下規則均勻的極細顆粒為固定相，所以傳質阻抗小，柱效高,一般在1×103~5×105 n/m)；②高速(采用2×103~3×104 kPa的高壓輸液泵輸送液體流動相，使其具有高流速,數分鐘至幾十分鐘可完成試樣分析)；③自動化操作，重復性高；④高效相色譜柱可反復使用；⑤高靈敏度(廣泛使用了高靈敏檢測器,只需要試樣10-7~10-2 g)。
2高效液相色譜法分類
高效液相色譜法按照分離機制可分為以下4種：
2.1液-液分配色譜法（liquid-liquid chromatography)
LLC根據流動相和固定相的極性不同又可分為，①正向LLC：流動相極性固定相極性，極性大的組分先流出色譜柱，適合非極性物質分離。
理論上應不相溶的固定相和流動相，實際上仍有少量微量固定相溶解，并且機械沖擊作用也會導致固定相流失，從而使柱的分離效率和選擇性降低, 目前主要采用化學鍵合固定相(即通過固定相的有機基團與載體（硅膠）表面的游離羥基發生化學反應，從而使固定相與載體鍵合起來)來克服這一問題。
2.2液-固吸附色譜法（liquid-solid adsorption chromatogramphy）
在吸附色譜中，組分分子和流動相分子對吸附劑（固定相）表面產生競爭性吸附，利用組分和固定相吸附力的不同而分離。
2.3離子交換色譜法(ion exchange chromatography)
離子交換劑上可解離的離子與流動相中組分離子進行可逆的離子交換，利用試樣中不同組分與離子交換劑具有不同的親和力而將它們分離的方法。
2.4空間排阻色譜法（凝膠色譜法）
試樣中分子量大小不同的組分進入凝膠柱時，組分分子滲入微孔的程度不同，大分子直接從間隙中越過，首先出柱，分子越小，進入微孔越深，保留值越大，溶劑分子通常最小，最后流出。主要用來分離高分子化合物，如蛋白質、多糖等。
3高效液相色譜法的應用
HPLC已成為應用最為廣泛和有效的分離分析手段，應用非常廣泛，目前，HPLC在醫藥、生化、天然產物主要成分的分析、食品分析、環境分析等方面都有廣泛的用途：
3.1醫藥方面
廣泛用于藥物的分離、分析、定量等[1-3]。
3.1.1藥物合成的分離精制在藥物合成反應中，作為人工合成藥物的精制手段，用于除去少量雜質，特別是那些異構體的分離。值得提出的是，藥物中R-型和S-型的光學異構體具有不同的生理作用。為了研究藥物的作用機制，需要拆分光學異構體(即對映體)，這是很困難的工作，而高效液相色譜在這方面顯示了獨特的長處。利用不同類型的手性固定相與對映體能生成穩定性不同的非對映異構體，從而達到分離目的。
3.1.2天然產物的分離分析天然產物的組分非常復雜，例如中草藥等，用高效液相色譜法進行分離分析，具有簡單快速的特點。
3.2在生命科學中的應用[4,5]
其在生化領域的應用主要集中于兩個方面：①低分子量物質，如氨基酸、有機酸、有機胺、類固醇等的分離和測定。②高分子量物質，如多肽、核糖核酸、蛋白質和酶（各種胰島素、激素、細胞色素、干擾素等）的純化、分離和測定。 過去對這些生物大分子的分離主要依賴于等速電泳、經典離子交換色譜等技術，但都有一定的局限性，遠遠不能滿足生物化學研究的需要。因為在生化領域中經常要求從復雜的混合物基質，如培養基、發酵液、體液、組織中對感興趣的物質進行有效而又特異的分離，通常要求檢測限達ng級或pg級，或pmol，fmol，并要求重復性好、快速、自動檢測；制備分離、回收率高且不失活。在這些方面，HPLC具有明顯的優勢。
3.3食品方面[6-8]
高效液相色譜法已經被廣泛應用于下面二個領域：①食品營養成分分析：蛋白質、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機酸（鄰苯二甲酸、檸檬酸、蘋果酸等）、有機胺、礦物質等；②食品添加劑分析：甜味劑、防腐劑、著色劑（合成色素如檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、亮藍等）、抗氧化劑等；③食品污染物分析：霉菌毒素（黃曲霉毒素、黃桿菌毒素、大腸桿菌毒素等）、微量元素、多環芳烴等。
3.4環境分析方面[9]
在對大氣中污染物的成分分析，廢水、廢汽和汽車尾氣中有害組分的分析中，高效液相色譜法發揮著很大的作用。
3.5農業方面[10]
在農業的發展中，高效液相色譜也發揮著很大的作用。它主要用來對各種農作物中營養成分進行分析，特別是對多糖、脂肪酸、蛋白質等分析都是極為有效的方法。
4 高效液相色譜法存在的問題
4.1渦流擴散（Eddy diffusion）
流動相碰到較大的固體顆粒，就像流水碰到石頭一樣產生渦流。如果柱裝填得不均勻，有的部分松散或有細溝，則流動相的速度就快；有的部位結塊或裝直緊密則流速就慢，多條流路有快有慢，就使區帶變寬。因此，固相載體的顆粒要小而均勻，裝柱要松緊均一，這樣渦流擴散小，柱效率高。
4.2分子擴散（Molecular diffusion）
分子擴散就是物質分子由濃度高的區域向濃度低的區域運動，也稱縱向分子擴散。要減少分子擴散就要采用小而均勻的固相顆粒裝柱。同時在操作時，如果流速太慢，被分離物質停留時間長，則擴散嚴重。
4.3質量轉移（Mass transfer）
被分離物質要在流動相與固定相中平衡，這樣才能形成較窄的區帶。在液相色譜中，溶質分子要在兩個液相之間進行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的時間。當流速快時，轉移速度慢，來不及達到平衡流動相就向前移，產生物質的非平衡移動，使區帶變寬。
4.4流動相流速
當流速太低時，分子擴散嚴重。如將理論塔板高度對流速作圖，理論塔板高度隨流速增加而急速下降，當達到最低值時，流速再加大則質量轉移起主要作用，理論塔板高度又加大。在高效液相色譜中，流速稍快影響不大，但在凝膠過濾色譜中，因為物質要滲透到凝膠內部，所以質量轉移影響大，流速加大會降低柱效率。
4.5固定相顆粒大小
固定相顆粒越小柱效率越高，對流動相流動的阻力越大，需要加大壓力才能使它流動。
5展望
高效液相色譜法雖存在上述不足之處，但由于分析速度快、分離效率高、檢測靈敏度高、檢測自動化、適用范圍廣、組分易回收、樣品處理較簡單等優點，從而在醫藥、食品、生化、環境分析等領域還是有著廣泛的應用前景。
[參考文獻]
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高效液相色譜范文第2篇
【摘要】
目的采用高效液相色譜（HPLC）法測定不同白芍藥材中芍藥苷含量，確定哪種白芍含芍藥苷最高。方法采用色譜柱：Hypersil C18柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸水（14：86）；檢測：UV 230 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃。結果2年生、10月份采收貯存期短的亳州白芍芍藥苷含量最高。結論該方法簡便準確可靠、重復性好。
【關鍵詞】 白芍 芍藥苷 高效液相色譜 質量
Abstract:ObjectiveTo compare the quality of different Radix Raeoniae Alba with HPLC methods. MethodsThe separation was carried out on Hypersil C18 column（4.6 mm×200 mm，5μm）； the mobile phase was acetonitrile-H2O (acidified to 0.05% with phosphoric acid)（14∶86）；the flow-rate was 1.0mml/min； the column temperature was 25℃. ResultsThere was the highest content of paeoniflorin in Radix Paeoniae Alba of two -year-growing time harvested in October with short storage time.ConclusionThe method is simple， rapid with good reproducibility.
Key words:Radix Paeoniae Alba； Paeontflorin； HPLC； Quality
白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall的干燥根，其主要成分為芍藥苷（Paeoniflorin）、芍藥內脂苷（Albiflorin）、氧化芍藥苷（Oxypaeoniflorin）、苯甲酰芍藥苷（Benzoylpaeoniflorin），通稱芍藥總苷（total glucosides of paeony， TGP）。具有抗炎、抗病毒、解痙鎮痛、護肝等多種藥理活性。白芍藥材及各種制劑均以芍藥苷含量為質量控制標準。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
高效液相色譜儀（四元泵、柱溫箱、MVD檢測器、Agilent1100 色譜工作站）、電子分析天平AE240 （十萬分之一，瑞士，METTLER-TOLEDO Co.）、CQ250超聲波清洗器（上海超聲波儀器廠）、UV-3300（日本日立公司）。
1.2 試藥
芍藥苷對照品（編號：0900-200102，含量測定用，中國藥品生物制品檢定所購），白芍藥材經江西中醫學院藥用植物學科組鑒定符合2000年版《中國藥典》白芍項下標準。乙腈為色譜純（Merk Co.），水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 對照品溶液制備
精密稱取白芍對照品適量，加50%乙醇制成每毫升含60 mg的溶液，搖勻，即得。
2.2 供試品溶液的制備
精密稱取本品干燥的粉末0.5 g，置50 ml容量瓶中，精密加入50%乙醇35 ml，超聲提取30 min，冷卻，加50%乙醇至刻度，搖勻，濾過，再過0.45 μm濾膜，取續濾液作為供試品溶液。
2.3 色譜條件
色譜柱： Hypersil C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）（大連Elite公司）；流動相：乙腈-0.05%磷酸水（14∶86）；檢測：UV 230 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃。理論塔板數以芍藥苷峰計算不得低于2 000。在上述色譜條件下，取對照品溶液、供試品溶液各進樣10 μl進行HPLC測定，結果見圖1～2。由圖中可見供試品中芍藥苷與芍藥苷對照品峰保留時間一致，并且與樣品中其它組分達到了很好的分離。
2.4 線性關系
考察精密稱取芍藥苷對照品0.024 80 g，置50 ml容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，即得到2.48 mg/ml的芍藥苷對照品溶液，從中分別精密吸取0.25，0.5，2.5，5.0，10.0和15.0 ml的對照品溶液，分別置6個25 ml的容量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液各10 μl，繪制標準曲線，得回歸方程Y=1 809.398 4X+2.213 5，r=0.999 99。
2.5 提取方法的確定
本實驗對提取溶劑、提取溶劑的濃度、提取時間、提取方法等進行綜合考察，最后確定供試品溶液的制備方法為：用50%乙醇超聲提取30 min即可。
2.6 精密度實驗
精密吸取同一份供試品溶液10 μl，重復進樣6次，測定芍藥苷峰面積積分值，RSD為0.80%。
2.7 重現性實驗
按“供試品溶液的制備”方法，對同一批樣品分別制備6份供試品溶液，各吸取10 μl進樣測定，測得芍藥苷含量RSD為0.72%。
2.8 穩定性實驗
取同一份供試品溶液在上述色譜條件下，分別在0，6，12，24，36，72 h各進樣10 μl，測定芍藥苷峰面積積分值RSD為0.64%。
2.9 回收率實驗
采用加樣回收測定法。分別精密稱取已知含量（芍藥苷1.778%）的樣品約0.25 g，共6份，分別加入一定量的對照品（濃度為0. 88 mg/ml，精密加入5 ml），按“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，進行HPLC測定，測得芍藥苷的平均回收率為99.92%，RSD為1.36%；結果見表1。結果表明，本法回收率高。表1 回收率實驗結果（略）
2.10 樣品含量測定
精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μl進樣測定，結果見表2。表2 13批樣品的芍藥苷含量測定結果（略）
3 討論
3.1 不同產地芍藥苷含量差異 從芍藥苷含量測定結果看，不同產地的白芍芍藥苷含量各不相同。其主要成分芍藥苷含量以亳州產白芍最高；本實驗所用亳州白芍為帶皮的根，與文獻［1］報道的未去皮白芍藥材中芍藥苷含量最高相符。
3.2 不同采收期芍藥苷量差異從芍藥苷含量測定結果看，以四川白芍為例，采收期8月份，9月份，10月份芍藥苷含量不同，采收期在10月份芍藥苷含量最高，與文獻［2］報道的采收期在10月份芍藥苷含量最高相符。
3.3 貯存期對芍藥苷含量的影響從白芍飲片1（貯存1年）、白芍飲片3（貯存2年）、白芍飲片4（貯存3年）芍藥苷含量測定結果看，隨貯存期的延長，白芍中芍藥苷的含量呈下降趨勢，所以白芍的貯存期不宜太長。
3.4 不同生長年限對芍藥苷含量的影響不同生長期亳州白芍中芍藥苷的含量不同，以2年生者含量最高，隨著生長期的延長，芍藥苷的含量呈下降趨勢。據有關文獻報道可能因為生長期長，淀粉含量增加，芍藥苷在體內轉化分解。這提示合理利用亳州白芍資源，可縮短生長期，增加芍藥苷含量，即經濟又有效。
總之，根據上述測定結果，可見本法操作簡單，重現性好，可作為白芍質量控制的有效方法。
參考文獻
［1］施大文，董欣，何婉霞．白芍的品質評價［J］.中藥材，1988， 11(4)：39.
高效液相色譜范文第3篇
【關鍵詞】 超高效液相色譜-串聯質譜; 玩具; 致癌染料; 致敏染料
simultaneous determination of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs in toys by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometryma qiang，bai hua*，wang chao，zhang qing，ma wei，zhou xin，dong yi-yang，wang bao-lin(chinese academy of inspection and quarantine，beijing 100123)(china agriculture university，beijing 100083)(dongning entry-exist inspection and quarantine bureau，dongning 157200)abstract a comprehensive analytical method based on ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry has been developed for the simultaneous determination of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs(acid red 26，basic red 9，disperse blue 1，acid violet 49，disperse blue 3，solvent yellow 1，dispersed blue 106，disperse orange 3，disperse yellow 3，basic violet 1，basic violet 3，disperse red 1，solvent yellow 3，disperse blue 124，solvent yellow 2 and disperse orange 37).various toy samples，including textile，leather，paper，wood，balloon，modeling clay，limitation tattoo and aqueous liquid，were extracted under ultrasonication.qualitative and quantitative analysis was carried out for the analyte under the mrm mode after the chromatographic separation on waters acquity uplc beh c18(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm) column.the limits of quantitation(loq) for the 16 dyestuffs were in the range of 1.0－8.0 μg/kg.the mean recoveries at the three spiked levels of 5－100 μg/kg were 81.3%－98.6%，with the intra-day precision less than 11% and the inter-day precision less than 14%.the method is accurate，rapid，sensitive，and adapt to the inspection of the 16 dyestuffs in toys.
keywords ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; toys; carcinogenic dyestuffs; allergenous dyestuffs
1 引言
我國是玩具產品的生產和消費大國，也是國際玩具產品的主要出口國。Www.133229.CoM玩具材料中含有的有毒有害化學物質可通過吞咽、舔食、皮膚接觸、眼睛接觸、吸入等方式進入體內，從而對兒童的健康安全造成嚴重危害， 玩具的安全性一直是社會關注的熱點問題〖1〗。在染色過程中，染料分子通過吸附、擴散等多種化學或物理處理，從染液轉移到被染物上而使之染色〖2〗。目前，已經證實存在多種可誘發人體癌變或引起人體皮膚、黏膜或呼吸道過敏的致癌和致敏染料〖3〗。鑒于致癌和致敏染料的嚴重危害，許多國家和世界權威組織相繼頒布了嚴格的法規和技術標準進行限制。按照歐洲標準化委員會制訂的en 71玩具安全系列標準對玩具化學性能的要求，酸性紅26、堿性紅9、分散藍1、酸性紫49、分散藍3、溶劑黃1、分散藍106、分散橙3、分散黃3、堿性紫1、堿性紫3、分散紅1、溶劑黃3、分散藍124、溶劑黃2、分散橙37等16種致癌和致敏染料在玩具產品中不得檢出〖4〗9噬鬧繁曜糘eko-tex standard 1000〖5〗、歐盟2002/371/ec指令〖6〗、我國國家標準《生態紡織品技術要求》〖7〗、環境保護行業標準《環境標志產品技術要求 生態紡織品》〖8〗也分別將酸性紅26等染料列為致癌和致敏染料。
目前，檢測致癌和致敏染料的方法主要有高效液相色譜法〖9~12〗、離子對色譜法〖13〗、液相色譜-質譜法〖10，11〗和氣相色譜-質譜法〖14〗等，但這些方法的靈敏度、選擇性和分析通量還存在不足。超高效液相色譜技術與傳統的液相色譜技術相比，大幅度改善了液相色譜的分析速度、分離效率、樣品通量和靈敏度。超高效液相色譜與串聯四極桿質譜聯用，能夠充分發揮超高效液相色譜的高速、高分離度與串聯質譜的高選擇性、高靈敏度的優勢，采用多反應監測掃描方式可提供特征的母離子及其子離子信息，為目標化合物的定性與定量分析提供了可靠依據。本研究建立了同時測定玩具中16種致癌和致敏染料的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法，在9 min內完成了16種染料多組分的快速分離檢測，為玩具樣品的高通量快速檢測提供了可靠的分析平臺，可應用于玩具的實際檢驗工作和產品質量控制。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
acquity超高效液相色譜儀、quattro micro api三重四極桿質譜儀、masslynx數據處理系統（美國waters公司）；milli-q超純水器（美國millipore公司）； kq-600b型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； ms2型漩渦振蕩器（德國ika公司）； n-1000型旋轉蒸發儀（日本eyela公司），配有bc-55型真空冷卻系統（日本yamato公司）； acrodisc ghp雙性濾膜（美國pall公司）； 乙腈、甲醇、無水乙醇（hplc級，美國fisher公司）； 乙酸銨（hplc級，美國acros公司）； 實驗用水為經milli-q凈化系統（0.22 μm過濾膜）過濾的去離子水； 氮氣、氬氣（>99.999%）； 其它試劑均為分析純。
酸性紅26（純度84%）、堿性紅9（純度95%）、酸性紫49（純度96%）、分散藍3（純度20%）、堿性紫1（純度30%）、堿性紫3（純度80%）、分散藍124（純度70%）和溶劑黃2（純度95%）購自德國dr.ehrenstorfer公司；分散藍1（純度30%）、溶劑黃1（純度99%）、分散藍106（純度95%）、分散黃3（純度30%）、分散紅1（純度95%）、和分散橙37（純度95%）購自美國sigma公司；分散橙3 (純度95%)和溶劑黃3 (純度99%)購自美國acros公司，16種染料的標準物質均為市場上最高純度標準樣品，它們的化學文摘號、染料索引號等參數見附表1（/table/090704.pdf）。
2.2 色譜條件
waters acquity uplc beh c18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（a）和5 mmol/l乙酸銨溶液，ph=5.0（b），梯度洗脫程序：0~2.0 min，28%~40% a；2.0~6.0 min，40% a；6.0~9.0 min，40%~95% a；9.0~9.5 min，95% a；9.5~10.0 min，95%~28% a。流速0.3 ml/min；柱溫30 ℃；樣品室溫度20 ℃；進樣量5 μl。
2.3 質譜條件
電噴霧離子源；正離子掃描；毛細管電壓4.0 kv；射頻透鏡電壓0.1 v；離子源溫度120 ℃；去溶劑氣溫度350 ℃；去溶劑氣流量600 l/h；錐孔氣流量50 l/h；光電倍增器電壓650 v；碰撞氣體為氬氣，碰撞氣壓0.32 pa； 多反應監測（mrm）模式檢測，16種染料的質譜分析參數見表1， mrm色譜圖見圖1。
表1 16種致癌和致敏染料的質譜分析參數（略）
table 1 ms parameters for 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs analysis
圖1 16種致癌和致敏染料的mrm色譜圖（略）
fig.1 mrm chromatograms of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs
色譜峰編號同表1（the peak numbers are the same as in table 1）.
2.4 標準儲備液和工作液的配制
準確稱取適量的各染料標準品，用甲醇溶解并定容至100 ml，配制成1000 mg/l標準儲備液，于－20 ℃下保存。準確量取各染料標準儲備液5 ml，用甲醇定容至100 ml，配制成50 mg/l混合標準儲備液。使用時，用甲醇逐級稀釋成混合標準工作液，于4 ℃下保存，現用現配。
2.5 樣品處理
2.5.1 紡織品、皮革、紙張、木材、氣球、造型黏土、貼紙材質玩具材料的處理 取代表性樣品，測試試樣應從單個樣品上的可觸及部分移取，同種材料可合并作為同一測試試樣，將其剪碎至3 mm×3 mm以下，混勻。準確稱取1.0 g試樣置于50 ml具塞錐形瓶中，準確加入15 ml無水乙醇，超聲提取15 min。將提取液轉移至50 ml雞心瓶中，殘渣再加入15 ml無水乙醇提取一次。合并提取液，用旋轉蒸發儀于40 ℃水浴減壓濃縮至近干，用氮氣緩慢吹干后，準確加入1 ml甲醇溶解殘渣，過0.20 μm微孔濾膜后，供uplc/ms/ms測定。
2.5.2 可接觸液體玩具材料的處理 取代表性樣品，測試試樣應從單個樣品上的可觸及部分移取，同種材料可合并作為同一測試試樣。準確稱取1.0 g試樣置于50 ml具塞錐形瓶中，準確加入15 ml無水乙醇，超聲提取15 min，將提取液轉移至50 ml雞心瓶中，用旋轉蒸發儀于40 ℃水浴減壓濃縮至近干，用氮氣緩慢吹干后，準確加入1 ml甲醇溶解殘渣，過0.20 μm微孔濾膜后，供uplc/ms/ms測定。
3 結果與討論
3.1 樣品處理方法的優化
酸性紅26等16種染料的正辛醇/水分配系數（kow）介于－0.83~4.58之間，極性范圍分布較寬，各染料均在無水乙醇中有較好的溶解性。因此，選擇無水乙醇為提取溶劑。為了減少操作步驟及獲得盡可能高的提取率，采用超聲提取方式對樣品進行提取。考察了不同提取時間（10， 15， 20和25 min）和提取次數（1， 2和3次）的提取效果，確定了最佳的樣品處理條件。
3.2 色譜條件的優化
3.2.1 色譜柱的選擇 采用亞微米小顆粒填料色譜柱可獲得更高的分離度、樣品通量和靈敏度。分別考察了具有不同選擇性的uplc色譜柱（規格均為50 mm×2.1 mm，1.7 μm）對16種染料的分離效果：c18及c8（直鏈烷烴）、shield rp18（內嵌有氨基甲酸酯極性基團）、phenyl（苯基連接在c6直鏈的硅甲基官能團上）、hilic（硅膠基質）、hss t3（三鍵c18烷基鍵合）。結果表明，16種染料在acquity uplc beh c18色譜柱上獲得了最為理想的分離效果。
3.2.2 流動相的選擇 分別考察了反相色譜常用的有機相溶劑（甲醇和乙腈）與不同種類和ph值的揮發性緩沖液組成的流動相體系，如甲醇（或乙腈）-5 mmol/l甲酸銨溶液（ph值分別調節為3.75， 4.00， 4.25， 4.50， 4.75， 5.00， 5.25， 5.50和5.75）、甲醇（或乙腈）-5 mmol/l乙酸銨（ph值分別調節為2.75， 3.00， 3.25， 3.50， 3.75， 4.00， 4.25， 4.50和4.75）、甲醇（或乙腈）-0.1%甲酸溶液等對染料化合物的色譜行為和離子化程度的影響。結果表明，以乙腈-5 mmol/l乙酸銨溶液（ph=5.0）作為流動相時獲得了最優的色譜峰形、分離效果和質譜信號響應。進一步比較了乙酸銨緩沖液離子強度的影響，乙酸銨溶液濃度從2 mmol/l變化到10 mmol/l的結果表明，5 mmol/l乙酸銨為最佳添加量。由于上述16種染料包括酸性染料、堿性染料、分散染料、直接染料等類別，化學結構上涵蓋了偶氮型、三芳甲烷型、蒽醌型、雜環型等，各染料的化學性質和保留性質相差較大，選擇梯度洗脫方式，通過優化流動相梯度洗脫條件實現了16種染料的有效分離。
3.3 質譜條件的優化
在esi+和esi－離子化模式下，分別進行全掃描以選擇適當的電離方式和準分子離子峰。實驗結果表明，大部分染料在離子源esi+電離方式下，可獲得較高豐度的〖m + h〗+母離子。酸性紅26、酸性紫49等含鈉染料的母離子為〖(m－nna)+(n+1)h〗+，堿性紅9、堿性紫1、堿性紫3等含氯染料的母離子為〖m－cl+h〗+，16種染料的二級質譜圖見附圖1（/fig/090704.pdf）。在確定各染料的母離子后，采用子離子掃描方式進行二級質譜分析，對子離子進行了優化選擇，確定定量離子和輔助定性離子，通過優化毛細管電壓、一級錐孔電壓、二級錐孔電壓、射頻透鏡電壓、碰撞能量、質譜分辨率等質譜參數，使每種染料的準分子離子與特征碎片離子產生的離子對強度達到最大。
3.4 uplc/ms/ms與hplc/ms/ms的比較
本研究組曾建立了同時測定玩具中酸性紅26等16種致癌和致敏染料的hplc/ms/ms方法，其完成一次樣品分析的時間為27 min， 流動相消耗量為27 ml（流速為1.0 ml/min）。而本方法在9 min之內即完成了對16種染料的分析測定，分析時間為hplc/ms/ms方法的1/3，顯著提高了樣品分析通量，完成一次樣品分析的溶劑消耗量僅為2.7 ml，為hplc/ms/ms方法的1/10，提高了分析速度，降低了分析成本，減少了廢液產生。
3.5 線性范圍和檢出限
分別配制一系列標準工作溶液，在選定的色譜條件和質譜條件下進行測定，16種染料的線性方程、線性范圍和相關系數見表2。以信噪比為10估算定量限（loq），16種染料的定量限為1.0~8.0 μg/kg。
表2 16種致癌和致敏染料的線性方程、線性范圍和相關系數（n=3）（略）
table 2 linear equations，linear ranges and correlation coefficients of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs(n=3)
3.6 方法的回收率和精密度
分別稱取經測定不含有16種染料的紡織品、皮革、紙張、木材、可接觸液體、氣球、造型黏土、貼紙等材質的玩具樣品1.0 g，分別添加不同濃度標準溶液，每個添加濃度6個平行樣，進行添加回收率和精密度實驗，用超高效液相色譜-串聯四極桿質譜進樣測定。在低、中、高的3個添加水平范圍內的平均回收率為81.3%～98.6%。16種染料中代表性物質的回收率和精密度結果見表3，全部結果見附表2（/table/090704.pdf）。在一日內不同時間點和不同日期（5 d內）測定的日內精密度均小于11%； 日間精密度均小于14%。
3.7 樣品測定
應用本方法對布絨、皮革、紙制、木制、泥制等不同類型的玩具樣品共25件進行了分析測定，均未檢出含有致癌和致敏染料。
表3 玩具（紡織品、皮革、紙張）中16種致癌和致敏染料的部分添加回收率結果（n=6）（略）
table 3 results of recovery for 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs in textile，leather and paper samples(n=6)
【參考文獻】
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高效液相色譜范文第4篇
關鍵字 HPLC；藥物；分析
中圖分類號R9 文獻標識碼A 文章編號 1674-6708（2014）112-0182-02
高效液相色譜法是20世紀60年代末70年代初發展起來的一種快速、高效的新型分離分析技術。，并且可以直接用于分析難揮發、熱不穩定及高分子樣品，彌補了氣相色譜法的弱點，擴大了色譜法的應用范圍，高效液相色譜法包括吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法和分子排阻色譜法，其中基于分配機理的高效液相色譜法在藥品檢驗中應用非常廣泛的一種儀器分析方法。
1離子色譜法在藥物分析中的應用
離子色譜法是美國 Small等人在離子交換色譜法的基礎上建立起來的一種離子分離分析液相色譜技術，以其靈敏、快速、精密度高、抗干擾能力強等優點，主要應用于藥物及合成中間體的分析、復雜組分中的某一組分鑒定、藥物離子的價態及形態分析等方面。
晏菊姣等建立了離子色譜法測定注射用頭孢他啶中碳酸鈉的含量，鈉離子濃度在2mg/L~20mg/L范圍內呈良好的線性關系（r=0.9992），平均回收率為100.6% （n=9），測得定量限為0.002mg/L，該方法采用 Ionpac CG12A，CS12A陽離子交換柱，淋洗液為18mmoL/L 甲烷磺酸，CSRS-ULTRA 4mm自動抑制循環模式，抑制電流為60mA。
張偉等采用高效陰離子交換色譜法測定人凝血因子Ⅷ中枸櫞酸離子的含量，采用 IonPac AS11-HC離子交換柱（4mm×250mm），流動相為20mmol/L的 NaOH 溶液，等度洗脫 20min，采用 ASRS 4mm陰離子抑制器，電導檢測器，測得枸櫞酸離子濃度在 0.1～2.0μg/mL范圍內，對照品色譜峰面積與枸櫞酸離子濃度呈良好的線性關系，r=0.9990，總平均回收率 97.80%，RSD為0.69%，該方法的檢測限為 0.01μg/mL，彌補了《中國藥典》三部（2010版）中規定方法的不足之處。
2反相高效色譜法在藥物分析中的應用
反相高效色譜法是指流動相極性大于固定相極性的分配色譜法，適用于分離非極性至中等極性的各類分子型物質，應用范圍也比正相色譜法更廣泛。
陳德志等建立同時測定咪達唑侖、硝西泮、地西泮3種藥物血藥濃度的反相高效液相色譜法，色譜柱為 Symmetry shield RP18 柱（250mm×4.6mm，5.0μm），流動相為甲醇 - 磷酸鹽緩沖液（55:45，v/v，pH2.15），咪達唑侖、硝西泮、地西泮質量濃度在 20-4000ng/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系（r≥0.9996，n=5），回收率98.2%～103.9%之間。
翁水旺等建立反相高效液相色譜法分離測定奧美拉唑腸溶膠囊的含量及有關物質的方法，采用 VARIAN C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，以甲醇 - 水 - 三乙胺 - 磷酸（67:33:0.3:0.12）為流動相，檢測波長為302nm，測得奧美拉唑在濃度4.0μg/ml~40.0μg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系，r=0.99999，平均回收率為100.3%，RSD為 0.17%。
鐘延霞等建立了反相高效液相色譜法測定吉非替尼的方法，采用Hypersil BDS C18-5μm（250mm×4.6mm）色譜柱，流動相為乙腈-0.15%三氟乙酸（體積比為2∶8），紫外檢測波長254nm，吉非替尼的質量為6.824 0μg~34.1200μg時線性關系良好，線性系數為0.99908，加標回收率大于95%，檢測底限為20.7248μg。
趙軍等建立了反相高效液相色譜法同時分離測定6種臨床最常用的頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢噻肟)，采用SHIM-PACK VP-ODS色譜柱，以乙腈及0.05mol/L HAC-NaAC緩沖溶液（pH=4.0）組成流動相梯度淋洗，在15min內分離并測定了上述 6 種頭孢菌素，6種藥物最低檢出限均可達到 0.20μg/mL。
3 超高效液相色譜在藥物分析中的應用
超高效液相色譜系指一種采用小顆粒填料色譜柱（粒徑小于2 μm）和超高壓系統（壓力大于105 kPa）的新型液相色譜技術，能顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，同時大大縮短分析周期，其較大的峰容量和更高的靈敏度更適于中藥中多成分的分析。
唐軍等建立了一種快速測定血栓通注射液中5種皂苷成分（三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd）含量的方法，應用新型的超高效液相色譜系統，使用1.7μm填料的BEH C18色譜柱（50mm×2.1mm），乙腈-水兩相溶劑梯度洗脫，5種皂苷成分在測定的濃度范圍內線性關系良好，r＞0.9984，RSD小于3.1%，最低定量限和最低檢測限可分別達到0.5ng和0.2ng，平均回收率均大于95.0%。
4 高效液相色譜聯用在藥物分析中的應用
胡曉玲等建立超高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS）測定健康人血漿中阿托伐他汀濃度，阿托伐他汀濃度在0.385ng/mL~15.400ng/mL線性關系良好，相關系數達0.9974，日內、日間RSD符合方法學要求。
陳吉漢等建立了超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS）測定雞肉與雞蛋中 6種他汀類藥物殘留量。色譜柱為BEH C18，以甲醇-0.1% 甲酸 5mmol 乙酸銨為流動相，梯度洗脫分離，6 種他汀類藥物在 1.0～100μg/kg濃度范圍內線性良好，r＞0.9910，檢出限和定量限分別為 0.1～0.5μg/kg和0.3μg/kg~2.0μg/kg。
王映紅等應用高效液相-核磁共振聯用技術（LC-NMR）對微量級蛇葡萄根提取物中混合物的各個組分進行分離，并獲得1H NMR及COSY譜，通過與此類化合物所建立的氫譜數據庫進行比較分析，確定了微克級的天然產物混合物中的主要組分的化學結構及立體結構，使微量天然混合物中的主要組分的化學結構及立體結構得到證實，充分體現了LC-NMR技術的微量、快速的特點。
5 結論
高效液相色譜法選擇性高、靈敏度高、分析速度快，并可同時用于有關物質檢查與含量測定的特點，成為醫藥研究的有力工具，在天然藥物及復方成藥分析，抗生素分析，手性藥物分析，臨床治療藥物檢測等領域均需用到HPLC的不同測定方法。
參考文獻
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[6]趙軍，朱晨，韓玲，等.反相高效液相色譜法同時分離和測定多種頭孢菌素.山東大學學報，2006，41(4):145-151.
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[9]胡曉玲，李煥德.UPLC-MS-MS法測定健康人血漿中阿托伐他汀濃度及藥物代謝動力學研究.中南藥學，2008， 6(4):400-403.
高效液相色譜范文第5篇
[關鍵詞] 珍;含量測定;高效液相色譜
[中圖分類號]R927.2[文獻標識碼]B [文章編號]1674-4721(2009)07(a)-134-02
珍由珍珠、牛黃、三七、黃芩提取物、冰片、豬膽汁等組成,具有清熱解毒,消腫止痛的功效,主要用于咽喉腫痛,瘡瘍熱癤[1]。為了更好地控制其質量,保證臨床用藥安全有效,本實驗采用了HPLC法測定了制劑中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[2-5],方法簡便、準確、可靠。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
島津LC-2010高效液相色譜儀,Intersil C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)。
1.2 試藥
人參皂苷Rg1對照品(Ⅰ)(供含量測定用,批號:0703-9812)、人參皂苷Rb1對照品(Ⅱ)(供含量測定用,批號:110704-200217)、三七皂苷R1對照品(Ⅲ)(供含量測定用,批號:0745-200006)(中國藥品生物制品檢定所提供);珍(北京因科瑞斯生物制品研究所提供);乙腈為色譜純,水為高純水,其余試劑均為分析純。
2 定量分析
2.1 色譜條件
Intersil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相乙腈(A)-水(B)梯度洗脫見表1,檢測波長203 nm,流速1.5 ml/min,柱溫30 ℃,進樣量10 μl,理論板數按Ⅲ峰計算應不低于2 000。在該色譜條件下,樣品中被測成分能夠達到基線分離,保留時間在15 min內,陰性無干擾,色譜圖見圖1。
2.2 對照品溶液的制備
精密稱取Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ對照品適量,加甲醇制成每1 ml含Ⅰ0.55 mg、Ⅱ0.45 mg和Ⅲ0.20 mg的混合溶液,即得。
2.3 供試品溶液的制備
取本品細粉適量(約1.5 g),精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 ml,稱定重量,加熱回流提取2 h,放冷,用甲醇補足減失的重量,濾過,精密量取續濾液25 ml,蒸干,殘渣加1%氫氧化鈉50 ml,分次溶解并移入分液漏斗中,用水飽和的正丁醇振搖提取5次(分別為30,30,20,20,20 ml),合并正丁醇液,用正丁醇飽和的水洗滌至中性,每次25 ml,正丁醇液另器貯存,合并水液,用水飽和的正丁醇30 ml振搖提取,醇液與上述正丁醇液合并,蒸干,殘渣加乙醚5 ml洗滌,棄去乙醚液,殘渣揮盡乙醚,加甲醇溶解,并移至10 ml量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過,取續濾液,即得。
2.4 陰性樣品溶液的制備
按珍處方,除去三七藥材,制備陰性對照樣品。按“供試品溶液的制備”項制備陰性樣品溶液。
2.5 線性關系考察
分別精密稱取Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ對照品適量,加甲醇溶解并稀釋,制得濃度分別為1.144 mg/ml、0. 948 mg/ml和0.434 mg/ml的對照品溶液。分別精密吸取該溶液1、2、5、7、10 ml,置于10 ml的容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,各進樣10 μl,連續進樣2次,按上述色譜條件測定峰面積。以對照品進樣量(X)為橫坐標,色譜峰峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線,回歸方程見表2。
2.6 精密度試驗
取同一批供試品溶液,在上述色譜條件下連續進樣5次,各樣品峰面積的RSD分別為:Ⅰ1.38%,Ⅱ1.11%,Ⅲ1.96%,表明精密度良好。
2.7 穩定性試驗
取同一批供試品溶液,在上述色譜條件下,分別于0,2,4,8,12,24 h測定,各樣品在24 h內峰面積的RSD分別為:Ⅰ0.69%,Ⅱ1.00%,Ⅲ1.88%,表明樣品在24 h內基本穩定。
2.8 重復性試驗
取同一批樣品,按擬定的方法平行測定6份,平均含量為Ⅰ8.21 mg/g,Ⅱ7.21 mg/g,Ⅲ1.97 mg/g,RSD分別為:Ⅰ0.82%,Ⅱ1.82%,Ⅲ1.91%,表明該方法的重復性較好。
2.9 加樣回收率試驗
精密稱取已知含量的樣品6份,各加入一定量的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,在上述色譜條件下測定,計算回收率,平均回收率分別為Ⅰ96.46%,Ⅱ98.17%,Ⅲ96.27%,RSD分別為:Ⅰ1.01%Ⅱ1.02%,Ⅲ1.06%
2.10 樣品測定
取五批樣品(批號:20041019、20041122、20050303、20050601、20050605),分別按“供試品溶液的制備”項制備供試品溶液,準確吸取供試液10 μl,在上述色譜條件下測定,總含量(mg/g)分別為5.11、5.14、5.14、5.11、5.16。
3 討論
3.1 流動相的選擇
通過參考有關文獻,測定三七中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的流動相多為乙腈-水梯度洗脫。經試驗,采用文中流動相,對照品及供試品溶液中各色譜峰均能達到基線分離,效果良好。
3.2 檢測波長的選擇
取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1對照品,加甲醇分別制成20、30、50 μg/ml的溶液,用紫外可見分光光度儀分別進行200～400 nm波長的掃描,可見人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1均在203 nm處有最大吸收峰,故選擇203 nm作為檢測波長。
本文提出的 HPLC法能簡便、靈敏、準確地測定珍的含量,能滿足質量控制需要。
[參考文獻]
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