基因工程制藥綜述
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基因工程制藥綜述范文第1篇
【關(guān)鍵詞】細胞培養(yǎng) 生物制藥 應(yīng)用
隨著生命科學理論和技術(shù)的飛速發(fā)展，細胞培養(yǎng)技術(shù)的地位和作用日益成熟，動物細胞培養(yǎng)的研究取得了可觀的效果，并且有著無限的應(yīng)用發(fā)展前景。主要的發(fā)展目標包括：開發(fā)生長密度高、目標產(chǎn)品分泌量大的細胞系；研制性能優(yōu)良、吸附與解離容易、重復(fù)利用的微載體；開展規(guī)模化的生物反應(yīng)器、檢測系統(tǒng)、細胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離耦合系統(tǒng)等；設(shè)計新型培養(yǎng)基促進生物制品安全；研究三維細胞的培養(yǎng)條件[1]。
生物制藥即運用生物化學、醫(yī)學、微生物學等原理和方法，利用生物機體、組織、細胞、體液等生產(chǎn)具有預(yù)防、診斷和治療功能的藥物制品。有關(guān)研究者采用基因重組技術(shù)或其他創(chuàng)新生物技術(shù)生產(chǎn)治療性藥物，主要產(chǎn)品有基因工程藥物、抗體工程藥物、疫苗等幾類。這些產(chǎn)品的開發(fā)研制及生產(chǎn)過程都離不開細胞培養(yǎng)技術(shù)。
1 疫苗生產(chǎn)
疫苗免疫是最有效的預(yù)防感染性疾病的措施之一。疫苗免疫是指利用病毒性制劑、細菌性制劑及類毒素等人工主動免疫制劑，通過作用于機體的免疫防御系統(tǒng)起到免疫應(yīng)答作用。傳統(tǒng)的流感疫苗生產(chǎn)多采用雞胚培養(yǎng)，但當面臨高致病性流感全球大流行、微生物感染、內(nèi)毒素殘余量多等問題時，傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)方法可能難以滿足疫苗市場的需求。隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)的完善及其優(yōu)點的體現(xiàn)積極推進使用細胞培養(yǎng)技術(shù)替代雞胚培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感疫苗，未來將會越來越多依靠細胞培養(yǎng)技術(shù)獲得理想的疫苗。與此同時也存在一些缺陷，尤其是哺乳動物細胞培養(yǎng)的病毒疫苗特別適合于工業(yè)的發(fā)展，應(yīng)用微載體大規(guī)模培養(yǎng)細胞生產(chǎn)流感疫苗，使得流感病毒適應(yīng)傳代細胞（如VERO細胞），該細胞不僅培養(yǎng)條件要求不高而且遺傳性狀穩(wěn)定，對多種病毒的感染敏感[2]，如利用生物反應(yīng)器大規(guī)模進行病毒繁殖，可實現(xiàn)流感疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)。MDCK細胞系是被公認為最適于生產(chǎn)甲、乙型流感病毒疫苗的細胞系，對流感病毒增殖快、感染效率高，且不易變異[3]。其中典型代表，如巴斯德公司利用1000L反應(yīng)器微載體培養(yǎng)Vero細胞生產(chǎn)人用狂犬病疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗。由此可見，利用細胞培養(yǎng)疫苗已成為目前疫苗研制的重要應(yīng)用方向。
2 單克隆抗體制備
單克隆抗體是由單一B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。研究Hb在帕金森病中的發(fā)病機制，李旭穎等[4]制備抗Hb單克隆抗體，由重組人Hb作為抗原免疫小鼠，并將其細胞融合及細胞培養(yǎng)制備成雜交瘤，經(jīng)過篩選獲得抗人Hb單克隆抗體雜交瘤株，體內(nèi)誘生法制備腹水經(jīng)過酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法進而獲得特異性抗Hb單克隆抗體。張培等[5]制備乙型腦炎病毒的單克隆抗體通過動物免疫、細胞融合、克隆和篩選等方法，應(yīng)用ELISA等免疫學方法進行特異性和亞型的鑒定，為快速檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。單克隆抗體藥物研發(fā)已經(jīng)被列入863計劃和國家重點項目，國內(nèi)已經(jīng)有2個治療性單抗產(chǎn)品準備生產(chǎn)，3個治療性產(chǎn)品處于臨床試驗階段，多個抗體藥物處于臨床研究階段，已經(jīng)批準的治療性單抗有31個，目前國內(nèi)正在進行臨床前研究的抗體藥物有：抗CEA嵌合抗體；抗破傷風抗體及抗乙型腦炎等[6]。
3 藥物篩選
藥物篩選是從天然或合成的化合物中篩選出高效的新藥或先導化合物。生物活性和藥理作用檢測所篩選出的高效的新藥或先導化合物，并根據(jù)檢測結(jié)果評價某一物質(zhì)的藥用前景，是新藥研究的最初過程和關(guān)鍵步驟。體外二維和應(yīng)用球狀聚集體、細胞片層、脫細胞基質(zhì)進行三維培養(yǎng)肝細胞的具體技術(shù)是進行藥物毒性檢測的重要途徑[7]。Kostadinava等建立了一種長時間的三維肝細胞共培養(yǎng)體系，比單層培養(yǎng)肝細胞能更好地檢測體內(nèi)藥物導致的毒性。細胞水平的藥物篩選更接近人體生理狀態(tài)，外界環(huán)境干擾少，準確率高，是細胞水平藥物篩選模型的核心技術(shù)高內(nèi)涵篩選。高內(nèi)涵藥物篩選主要在微陣列多孔板上完成，通過在微孔板上進行細胞培養(yǎng)，施加藥物刺激進行實驗操作和數(shù)據(jù)的采集和分析。HCS技術(shù)可完成各種對于細胞生理現(xiàn)象本質(zhì)的研究，Talyor等[8]提出高內(nèi)涵概念，HCS模型主要建立在細胞水平，通過觀察樣品對固定或動態(tài)細胞的多個功能的作用，涉及各種不同的靶點，從多個角度分析樣品的作用，最終確定樣品的活性和可能的毒性。近年來發(fā)展起來的微流控芯片技術(shù)有可能成為細胞水平藥物篩選的理想選擇。Ye等[9]構(gòu)建了一套用于細胞水平藥物篩選研究的集成化微流控芯片系統(tǒng)，它可以將細胞種植、培養(yǎng)、標記、加藥、梯度稀釋等操作通過微通道網(wǎng)絡(luò)流體控制技術(shù)集成到一張芯片完成，保持了細胞結(jié)構(gòu)的完整性，可全面記錄細胞對藥物刺激的各種反應(yīng)。
基因工程制藥綜述范文第2篇
1原核表達系統(tǒng)
1.1大腸桿菌(Escherichiacoli)－典型的原核表達系統(tǒng)1977年，Itakura等成功地在E.coli中表達了一種哺乳動物的肽類激素－生長激素抑制素，從而首次實現(xiàn)了外源基因在原核細胞中的體外表達。這被認為是基因工程發(fā)展史上的一座里程碑。
1.1.1T7表達系統(tǒng)基于T7RNA聚合酶(T7RNApolymerase，T7RNAP)及其強啟動子之間的特異性和轉(zhuǎn)錄的高效性建立的pET系統(tǒng)(No-vagen)是最常用的E.coli表達系統(tǒng)。T7RNAP機制在誘導蛋白表達時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白，而且表達產(chǎn)物產(chǎn)量也特別高［2］。由λpL/cI(例如InvitrogenpLEX)、Trc(例如AmershamBi-osciencespTrc)、Tac(例如AmershamBiosciencespGEX)、lac/T5(例如QiagenpQE)等啟動子構(gòu)成的其他原核表達體系也常用于重組蛋白的原核表達［3］。
1.1.2目的蛋白表達形式及在細胞中的定位一般來說，在E.coli中表達的外源蛋白可以分為三類:可溶性蛋白、分泌蛋白以及包涵體蛋白。(i)可溶性蛋白是目的蛋白與一段融合標簽序列(FLAG、His－Tag、GFP等)融合表達而形成。這些融合標簽將為進一步的蛋白濃縮、提純、檢測等提供便利，同時也可以有效的抑制宿主蛋白酶的降解活性［4－6］。(ii)采用信號肽序列可以將蛋白直接分泌到細菌的周質(zhì)腔去。分泌表達可以顯著降低胞內(nèi)蛋白酶對蛋白的降解作用、簡化蛋白純化過程，同時有助于重組蛋白形成正確的空間結(jié)構(gòu)。大腸桿菌中，已成功使用了各種不同類型的信號肽，將細胞質(zhì)中表達的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)［7］。(iii)包涵體蛋白的形成是由于肽鏈折疊過程中，部分折疊中間態(tài)發(fā)生特異性錯誤聚合，不能形成成熟的天然或完全解鏈的蛋白所致。包涵體表達雖然可以避免蛋白酶對外源蛋白的降解，但對表達產(chǎn)物的活性不利。因此，需要后續(xù)的溶解與復(fù)性等。
1.1.3外源基因在大腸桿菌中表達的優(yōu)缺點迄今為止，E.coli作為第一個用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，由于其遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高、生長繁殖快、成本低廉，且可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點而被廣泛地用于外源蛋白的表達［8］。但是，作為原核表達宿主的E.coli不能產(chǎn)生諸如N－和O－端糖基化、脂肪酸酰化、磷酸化以及二硫鍵的形成等翻譯后修飾。而這些修飾作用對活性蛋白的生物活性、功能、結(jié)構(gòu)、溶解度、穩(wěn)定性，以及半衰期等都是非常重要的。而且，E.coli表達的蛋白還會保留它們氨基末端的甲硫氨酸，這會影響到目的蛋白的穩(wěn)定性，并產(chǎn)生免疫原性［9，10］。
1.1.4大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究新進展近幾年來，對大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究，已經(jīng)從最初的構(gòu)建不同的表達載體建立新的表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)移為完善現(xiàn)有的表達系統(tǒng)，解決表達系統(tǒng)中的各種缺陷，包括:采用RosettaTM(No-vagen)代替BL21菌株來增強含有E.coli稀有密碼子的重組蛋白的表達水平;采用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS以及BL21(DE3)pLysE(Invitrogen)彌補高濃度的胞內(nèi)酶環(huán)境對具有生物活性的目的蛋白在E.coli中表達的抑制等［11］。最近幾年來，研究人員逐步將研究重點放在通過將一些具有活性的小蛋白與目的蛋白融合，進而促進目的蛋白在E.coli中的表達［12］，或者通過改造某種現(xiàn)有的表達載體，通過將各種促溶標簽與載體融合，進而使得某些在E.coli中不表達的蛋白得以表達或使原本以包涵體形式表達的蛋白以可溶性形式表達［13］。這些標簽包括FLAG、MBP、GST、thioredoxin等。
1.2枯草桿菌－可替代E.coli的原核表達系統(tǒng)枯草桿菌，學名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtili)，細胞壁不含內(nèi)毒素，是一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌。1958年，Spiz-izen等首次發(fā)現(xiàn)枯草桿菌168菌株能夠攝取外源基因。此后，隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，以枯草桿菌為宿主細胞的表達系統(tǒng)迅速發(fā)展起來。
1.2.1枯草桿菌作為外源基因表達宿主存在的優(yōu)缺點作為外源基因表達的宿主，枯草桿菌有以下優(yōu)勢:①非致病的土壤微生物，不產(chǎn)生脂多糖，而脂多糖作為E.coli表達產(chǎn)物之一，有可能會導致人類和動物的一些神經(jīng)性退行病的發(fā)生。②遺傳特性強，很多噬菌體和質(zhì)粒都可以作為克隆載體。③蛋白分泌能力強，有利于目的蛋白的回收和純化。④良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)，枯草桿菌在工業(yè)上長期被用于生產(chǎn)蛋白酶、α－淀粉酶等，在相對簡單的培養(yǎng)基中就能生長到很高的密度［14］。經(jīng)過很多年的努力，許多原核和真核基因都已經(jīng)在芽孢桿菌表達系統(tǒng)中得以克隆和表達，其中有的已應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。但是，枯草桿菌作為產(chǎn)品生長菌也暴露出一些問題:蛋白酶對目的蛋白的降解、質(zhì)粒的不穩(wěn)定性、真白分泌量低甚至不能分泌表達等。目前，研究者已經(jīng)對B.subtilis全基因序列進行測序分析，同時對源于細胞膜和質(zhì)膜的蛋白酶的進行了研究［15－17］。因此，枯草桿菌作為表達宿主的這些弊端將在不久的將來得以解決。
1.2.2枯草桿菌表達系統(tǒng)的研究新進展與大腸桿菌相比枯草桿菌具有很強的向胞外分泌蛋白的能力，但是重組表達質(zhì)粒在枯草桿菌中卻不是很穩(wěn)定。所以研究者一直致力于對該系統(tǒng)本身進行更詳盡的研究上。通過尋找自然界中的這樣一類枯草桿菌，它們不僅具有強分泌蛋白能力，并且沒有胞外蛋白酶活性(如短芽孢桿菌)［18］，進而減少蛋白酶對蛋白的降解，促進蛋白的分泌表達。解決重組質(zhì)粒不穩(wěn)定的一種有效途徑是將克隆基因整合到枯草桿菌的染色體上，隨染色體的復(fù)制而復(fù)制［19］。
2真核表達系統(tǒng)
2.1酵母－最具商業(yè)價值的表達系統(tǒng)2.1.1幾種常見的酵母表達系統(tǒng)釀酒酵母(S.cerevisiae)是一種單細胞真核微生物，長久以來被稱為真核生物中的“大腸桿菌”，最早應(yīng)用于酵母基因的克隆和表達。目前利用釀酒酵母為宿主細胞表達了多種外源基因，如乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細胞集落刺激因子、人血管抑制素等［20，21］。1983年，美國Wegner等人最先發(fā)展了以甲基營養(yǎng)型酵母(methylotrophicyeast)為代表的第二代酵母表達系統(tǒng)。甲基營養(yǎng)型酵母包括:Hansenulapolymorpha、PichiaPastoris、CandidaBodinii等［22］。以Pichiapastoris(畢赤巴斯德酵母)為宿主的外源基因表達系統(tǒng)近年來發(fā)展最為迅速，應(yīng)用也最為廣泛。粟酒裂殖酵母(S.pombe)是所有酵母細胞中生理特性最接近高等生物的一種，其染色體結(jié)構(gòu)和功能，細胞循環(huán)的控制，RNA剪接蛋白表達分泌機制及翻譯后修飾等都與哺乳動物細胞很相似。因此，在S.pombe中表達的重組蛋白有可能更接近其本來的結(jié)構(gòu)和生物活性。近年來，有學者提出它可能也是潛在的能有效表達真核膜蛋白的表達系統(tǒng)［23］。
2.1.2酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點酵母表達系統(tǒng)具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工能力，有利于真白的表達，特有的AOX強效啟動子使得外源基因表達量很高，而且酵母的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵等操作接近原核生物，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，另外用甲醇代替IPTG作為誘導物，部分甲醇酵母以甲醇等工業(yè)產(chǎn)物代替葡萄糖作為碳源，生產(chǎn)成本非常低。但是酵母在表達外源基因時會造成產(chǎn)物蛋白的不均一、降解、信號肽加工不完全、多聚體形成等問題。而且，釀酒酵母表達蛋白時會出現(xiàn)蛋白切割問題、蛋白分泌效率低等問題。隨著酵母基因組測序的完成及后基因組的發(fā)展，人們對酵母的基因表達調(diào)控機制和對表達產(chǎn)物的加工修飾及分泌能力將更加清楚，相信不久的將來，這些問題都將得到解決［24］。
2.1.3酵母表達系統(tǒng)的研究新進展近年來出現(xiàn)的酵母展示技術(shù)利用酵母細胞壁上的某些蛋白:如酵母凝集素、酵母絮凝素等，可以實現(xiàn)外源蛋白再酵母細胞壁上的表達。但該技術(shù)僅限于蛋白在酵母中的分泌表達，融合蛋白再分泌表達途中由于其糖基化蛋白與細胞壁的結(jié)合作用，將外源蛋白錨定在細胞壁上［25］。目前，其技術(shù)還不是很成熟，后期純化過程并未提到。
2.2昆蟲/桿狀病毒表達系統(tǒng)－最具潛力的表達系統(tǒng)桿狀病毒表達外源蛋白的前提要將目標蛋白編碼序列克隆至合適的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體上，目的基因與桿狀病毒的基因組通過同源重組制備重組病毒DNA，進而感染昆蟲細胞產(chǎn)生重組蛋白。
2.2.1昆蟲/桿狀病毒表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點桿狀病毒做為外源基因表達的宿主，由于其可以對真白進行翻譯后加工等過程而被廣泛地用于真核基因的體外表達。目前，已經(jīng)有近千種異源蛋白在此系統(tǒng)中得到高效表達，而且桿狀病毒還可以用于生產(chǎn)疫苗、基因治療以及制備桿狀病毒殺蟲劑等［26］。由于昆蟲是桿狀病毒的自然宿主，且每種桿狀病毒都只能感染一種或幾種昆蟲，不會感染其他動物、植物及人類，所以認為在應(yīng)用桿狀病毒進行研究時不需考慮其安全性問題［27］。但是，桿狀病毒表達系統(tǒng)也存在著一定的缺陷。例如，隨著感染宿主的多角體病毒的死亡，異源蛋白不能連續(xù)表達。每一輪新蛋白的合成都需要重新感染宿主細胞。此外，雖然桿狀病毒表達系統(tǒng)能夠?qū)δ康牡鞍鬃龇g后修飾，但這種修飾存在著一定的限度;雖然其糖基化位點與在哺乳動物細胞中一樣，但寡糖鏈的性質(zhì)有所不同，無法產(chǎn)生復(fù)雜的糖基側(cè)鏈，這可能是由于昆蟲細胞不能將成熟糖鏈加工成哺乳動物細胞中類似的形式。
2.2.2昆蟲/桿狀病毒表達系統(tǒng)的研究新進展起初，桿狀病毒系統(tǒng)的所用到的重組質(zhì)粒都是通過同源重組的方法獲得，利用桿狀病毒基因組DNA與供體質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，這樣重組病毒與原病毒混雜在一起，分離篩選效率非常低，重組效率僅為0.1%［28］。后來，研究者發(fā)現(xiàn)利用核多角點中的Bsu36I酶切位點將其病毒基因組線性化極大地推動了該系統(tǒng)發(fā)展，線性化的病毒DNA與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞重組效率大大提高，大約為25%［29］。利用病毒桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外源蛋白的過程中，病毒本身也表達出蛋白酶，尤其是半光氨酸蛋白酶v－cath，會對重組蛋白進行降解。研究發(fā)現(xiàn)通過該在桿狀病毒基因組，刪除導致導致重組蛋白降解的蛋白酶基因，可以有效保證外源基因表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性［30］。另外，多角體啟動子及其上游序列對外源蛋白的基因轉(zhuǎn)錄也很重要，在新開發(fā)的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中，為提高表達效率在3’端常添加真核增強因子SV40等序列。
2.3哺乳動物細胞表達系統(tǒng)———一個相對成熟的真核表達系統(tǒng)從最開始以DNA直接轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞至今的幾十余年間，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)已成為多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺，且在新基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究中亦起了極為重要的作用［31］。根據(jù)表達產(chǎn)物用途不同，該表達系統(tǒng)既可以用于瞬時表達也可用于穩(wěn)定表達。COS細胞常用于前者，CHO細胞用于后者。
2.3.1哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點與其它真核細胞表達系統(tǒng)相比，目的基因在哺乳動物細胞中表達的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎完全相同，并且在蛋白合成起始信號、加工、分泌等方面具有獨特優(yōu)勢。但是哺乳動物表達系統(tǒng)成本相對較高，技術(shù)復(fù)雜，表達過程中存在著潛在的動物病毒的污染。
2.3.2哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的研究新進展由于哺乳動物細胞表達蛋白的成本較高，因此如果蛋白能夠在胞外分泌表達，這樣就會大大降低生產(chǎn)成本，有利于實現(xiàn)重組蛋白在哺乳動物細胞表達的工業(yè)化生產(chǎn)。為了方便蛋白大量生產(chǎn)以及后期純化，研究者通常會選擇在載體或者目的片段上添加信號肽序列，這樣可以增強蛋白的胞外分泌能力。王洪亮等通過在載體上添加CD5L引導肽序列，使得重組蛋白在哺乳動物細胞中得到很好的表達［32］。
2.4其他真核表達系統(tǒng)———一些新興的表達系統(tǒng)隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，人們對重組蛋白表達的研究也逐步深入，近些年來，除了上述一些常規(guī)的表達系統(tǒng)，研究者又逐步發(fā)現(xiàn)了一些新興的表達系統(tǒng)，這些表達系統(tǒng)主要包括植物和動物細胞/組織表達系統(tǒng)。
基因工程制藥綜述范文第3篇
【關(guān)鍵詞】 細胞
【關(guān)鍵詞】 臍血干細胞；移植；免疫治療
臍血造血干細胞移植融化療與免疫治療于一體，作為血液惡性疾病的治療手段已獲公認，其重要原因就是臍血造血干細胞移植比其他造血干細胞移植具有諸多優(yōu)點：來源豐富、取材簡單；對供、受者HLA相符的要求相對較低；不易受病毒及殘留腫瘤細胞的污染；CD3、CD4相對不成熟，GVHD發(fā)生率低；NK細胞、LAK細胞較多，GVL發(fā)生率低；增殖、自我增殖能力強；骨髓基質(zhì)細胞多，給造血干細胞提供生長的微環(huán)境等。造血干細胞移植的臨床快速發(fā)展豐富了移植免疫理論，移植免疫的進展亦促進了造血干細胞移植的臨床實踐。臍血造血干細胞移植亦存在諸多免疫方面的問題，如GVHD、GVL、免疫耐受等發(fā)生率雖較低但均有其免疫的機制。為更好地理解、認識及進一步解決這些問題，本文將從相關(guān)免疫學的角度對這些現(xiàn)象作一綜述。
1 T細胞抗原識別和激活的分子基礎(chǔ)
臍血造血干細胞移植時，由于受者在移植前接受了預(yù)處理的超大劑量放/化療，受者免疫受到抑制，因此，更多的情況是發(fā)生供者對受者的免疫反應(yīng)，供者的T細胞被激活。T細胞可通過特異性和非特異性抗原兩條途徑被激活。在移植免疫中起重要作用的是抗原特異性激活。抗原特異性激活需要T細胞與“專業(yè)化”的抗原遞呈細胞（APC）反應(yīng)。APC在不同條件下由不同細胞組成，主要包括樹突狀細胞、巨噬細胞、激活的B細胞、單核細胞等。T細胞的激活可人為地分為三個階段：第一階段為粘附：APC與T細胞通過細胞表面粘附分子及其配體在外周血與淋巴細胞隨機接觸發(fā)生反應(yīng)。細胞表面粘附分子包括LFA3及其配體CD2、ICAM1、LFAⅠ等。第二階段為識別：在粘附的基礎(chǔ)上，若APC可呈遞足夠量的特異性抗原多肽給T細胞，則T細胞可通過T細胞受體對抗原進行識別。T細胞受體抗原的識別受MHC限制性，內(nèi)源性抗原肽通過MHCⅠ類分子提呈給CD8+的TCR，外源性抗原肽通過MHCⅡ類分子提呈給CD4+的TCR。第三階段為T細胞的激活：TCR與抗原肽的結(jié)合使T細胞具備被其它信號激活進而分化、增殖和分泌細胞因子的能力；但若缺乏其它信號的刺激，則不能被激活或發(fā)生增殖和分泌細胞因子。TCR與抗原的結(jié)合是T細胞激活的第一信號，第一信號具有抗原特異性和MHC限制性；第二信號則是非特異性的：CD28僅局限表達于T淋巴細胞和漿細胞，但直到80年代末期、90年代初期才確定了CD28在APC表面的配體B71（CD80）、B72（CD86）。越來越多的資料顯示，B71和B72途徑可能傳遞不同的共刺激信號。也有證據(jù)顯示B7家族中可能尚有其它組成成份。這些分子的發(fā)現(xiàn)無疑會對B7/CD28共刺激信號乃至免疫激活的理論發(fā)生沖擊。因此，T細胞通過粘附分子與APC接觸，進而識別APC呈遞的抗原多肽。通過B7/CD28等多個黏附分子對傳遞第二信號，進而T細胞被激活發(fā)生增殖、分泌不同的細胞因子。T細胞激活后表面表達另一分子――CTLA4，結(jié)構(gòu)與CD28類似，但與B7分子結(jié)合后發(fā)揮的作用與其相反，在共刺激信號中發(fā)揮重要的負調(diào)節(jié)作用，抑制T細胞過度增殖。因而通過調(diào)控粘附分子、第二信號系統(tǒng)，可以改變免疫反應(yīng)；若阻斷粘附分子或TCR與抗原的接觸，則T細胞發(fā)生抗原識別的最終結(jié)果是免疫抑制；這些細胞再次遇上特異性抗原，仍會發(fā)生免疫反應(yīng)；但若調(diào)控發(fā)生在B7/CD28階段，則結(jié)果完全不同，這些細胞由于已與特異性抗原肽發(fā)生接觸，此時阻斷第二信號B7/CD28，則細胞進入一長久的特異性免疫無反應(yīng)狀態(tài)，即使再次遇上此抗原，仍無法發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)［1～3］。
2 免疫耐受
宏觀上講，有三條途徑可以達到免疫耐受。第一是克隆清除，第二是克隆失能，第三是免疫抑制。同其他大器官移植不同，異基因造血干細胞移植最終可不必使用免疫抑制劑而達到免疫耐受。雖然確切的免疫耐受機制尚未完全闡明，但臨床和實驗室資料支持上述三種機制并存。例如，慢性GVHD病人存在特異性對宿主起反應(yīng)的供者淋巴細胞，而無慢性GVHD的病人則無此類細胞。換言之，在無慢性GVHD的受者，針對宿主的淋巴細胞被克隆清除或克隆失能。同樣，在動物試驗中，有急性GVHD表現(xiàn)的動物體內(nèi)可發(fā)現(xiàn)特異性對宿主抗原反應(yīng)的T細胞克隆。而在無急性GVHD的動物則極難分離出上述T細胞克隆。當然，也有第三種機制參與免疫耐受機制及免疫抑制的證據(jù)：臨床及動物試驗發(fā)現(xiàn)有抗原特異性和抗原非特異性免疫抑制細胞的存在，免疫抑制藥物對造血干細胞移植免疫耐受形成的重要性等均支持免疫抑制機制的參與。由于免疫耐受對造血干細胞移植的重要性，近年全世界科技工作者花費大量的財力、物力和人力對免疫耐受進行了研究，試圖在免疫耐受機制和誘導免疫的方式上取得進展。
2.1 免疫抑制劑的進展
用于造血干細胞移植的免疫抑制藥物主要是環(huán)孢素A。環(huán)孢素A的應(yīng)用使移植的免疫合并癥明顯減輕，使移植療效大為改進。近年來，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素FK506、MMF等新型免疫抑制劑的應(yīng)用，有望進一步提高移植的安全性。尤其是FK506能使HLA不合的造血干細胞移植形成免疫耐受。上述藥物可分別通過抑制某些細胞因子（尤其是IL2）的產(chǎn)生，阻斷細胞因子與受體的結(jié)合，干擾細胞因子受體的表達等機制而發(fā)揮免疫抑制作用［4，5］。
2.2 特異性免疫耐受的誘導
迄今為止，僅在動物模型上獲得成功。臍血移植屬異基因造血干細胞移植，以下兩方面的進展值得一提：①通過阻斷共刺激信號即第二信號，誘導免疫耐受。如前所述，T細胞的激活需第一、二信號；CD28/B7在第二信號中發(fā)揮重要作用。應(yīng)用阻斷CD28/B7的制劑，可干擾T細胞的特異性激活，細胞進入免疫無能狀態(tài)；CTLA4Ig或B7抗體可用來達到此目的。動物實驗表明，必須完全阻斷B7家族的信號傳導，方能誘導MHC不合的免疫耐受；體內(nèi)應(yīng)用CTLA4Ig雖能明顯降低MHC不合移植致死性GVHD發(fā)生率，但并不能完全消除致死性GVHD。體內(nèi)體外聯(lián)合阻斷B7/CD28信號傳導可能會獲得更好的結(jié)果。②基因工程。供者T淋巴細胞是GVHD的關(guān)鍵細胞，體外去掉之無疑會減輕GVHD，但同時會使異體植入發(fā)生困難，尤其是HLA不合的異基因造血干細胞移植。由于認識到植活主要是T細胞的早期功能事件，而GVHD往往是植活以后發(fā)生。因此近年有學者試圖用基因工程的方法誘導免疫耐受；體外將標記基因重組到供者T淋巴細胞上，后者與DHPG接觸后即出現(xiàn)凋亡。結(jié)果既能保證植活的需要，而且一旦發(fā)生GVHD則可應(yīng)用DHPG輸注誘導T細胞凋亡，阻止GVHD的發(fā)生。③嵌合體形成免疫耐受。動物實驗證實，用CD4單抗對受者進行的非清除性造血干細胞移植可形成供受者嵌合，若供受者形成嵌合體狀態(tài)，則不易發(fā)生GVHD，其機制雖未獲闡明，很可能是T細胞克隆被清除或有veto細胞的存在。最大的問題是如何設(shè)計一有效的非清除性方案使之能形成嵌合狀態(tài)。臨床應(yīng)用非清除性造血干細胞移植在HLA相合的異基因移植獲一定成功，但未能完全避免GVHD，提示人與動物實驗仍有一定差異。此一方法能否跨越HLA不合的免疫屏障，尚有待進一步臨床證實［6～12］。
3 急性GVHD
急性GVHD是異基因造血干細胞移植的主要合并癥，其發(fā)生的基礎(chǔ)在于供受者MHC及次要組織相容性的差異。有關(guān)其發(fā)生的細胞和分子機制近年已越來越清楚。由于受者機體處于免疫抑制狀態(tài)，供者T細胞（主要是成熟T細胞）被激活。激活的過程同上。由于預(yù)處理并不能安全清除受者APC，故受者APC直接將MHC或次要組織相容性抗原處理為多肽后呈遞給供者T細胞。供者T細胞被激活分泌大量細胞因子，如IL2及其受體。這些因子一方面可刺激T細胞的增殖和細胞因子再分泌，另一方面尚可促進APC的活性及其他分子的分泌，如粘附分子、MHC的高表達等。
T細胞激活后如何導致組織的損害尚有諸多不甚清楚之處。早年認為細胞毒性T細胞直接導致組織損害和壞死。然而，此一假設(shè)近年漸被擱置。越來越多的試驗證據(jù)表明，大顆粒細胞――NK細胞無疑對GVHD的組織損害發(fā)揮一定作用；細胞因子如TNF、IL1等對GVHD組織損害的作用也越來越獲肯定［13，14］.
4 慢性GVHD
慢性GVHD由于有類似于膠原血管炎性疾病的臨床表現(xiàn)，一般認為與急性GVHD不同，更可能是一種自身免疫性疾病。早期常以100 d作為鑒別急、慢性GVHD的標準。但近年的資料表明，慢性GVHD應(yīng)更好地從臨床、病理和發(fā)病機制方面加以認識。雖然從臨床的角度非常難確定GVHD與自身免疫的關(guān)系，動物試驗已證實慢性GVHD呈自身免疫性疾病的病理生理過程。在動物模型中，源于慢性GVHD的T細胞特異性對MHCⅡ類分子的公共抗原簇發(fā)生反應(yīng)，既使在無IL2的條件下仍可分泌因子IL4和IFNγ，并且刺激纖維母細胞產(chǎn)生膠原蛋白。GVHD的發(fā)生可能與受體胸腺功能受到破壞，使之不能對針對自身抗原的T細胞實行克隆清除，后者由供者造血干細胞分化而成［15］。
5 同基因GVHD
病理改變類似慢性GVHD。動物模型研究表明，其發(fā)生機制是由于自身免疫性T細胞針對MHCⅡ類抗原分子。自身免疫性T細胞發(fā)生的機制是由于胸腺嚴重受損，髓質(zhì)（Medulla）內(nèi)缺乏表達MHCⅡ類抗原的細胞，因而在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟并移至外周血的T淋巴細胞可以導致組織損害，而其他可以滅活自身免疫的免疫監(jiān)視細胞又由于預(yù)處理（如放射線）而遭滅活。將正常淋巴細胞回輸給照射后的動物宿主，可以恢復(fù)宿主的調(diào)節(jié)功能，從而預(yù)防此免疫過程。環(huán)孢素A由于可以阻止此免疫監(jiān)視機制的重建，因而在誘發(fā)同基因（或自體）GVHD中起重要作用［16］。
6 GVL效應(yīng)
諸多事實證明移植物抗白血病效應(yīng)（GVL）的存在：①免疫抑制劑的驟停可使復(fù)發(fā)（主要是分子生物學和細胞遺傳學復(fù)發(fā)）病人再次進入緩解狀態(tài)；②異基因造血干細胞移植復(fù)發(fā)率低于同基因造血干細胞移植；③發(fā)生急、慢性GVHD的病人復(fù)發(fā)率低于不發(fā)生GVHD的病人；④接受非去T細胞造血干細胞移植且無急、慢性GVHD發(fā)生的病人，移植后復(fù)發(fā)率仍低于同基因移植。這些資料不僅支持GVL效應(yīng)，并且表明即使無GVHD發(fā)生，仍發(fā)生GVL效應(yīng)。在不同疾病種類作用強度不同。如在AML和CML作用明顯，但對ALL則作用較弱。而在多發(fā)性骨髓瘤中，GVL效應(yīng)最弱［17］。
GVL的效應(yīng)細胞和分子機制目前尚未清楚的闡明。不過，供者T細胞無疑發(fā)揮重要作用。因為去除供者T細胞后，GVL效應(yīng)明顯減弱。誘發(fā)GVL、GVHD的抗原是否為同一抗原，激活的是否為同一效應(yīng)細胞等問題均尚待進一步明確。初步資料表明MHC、次要組織相容性抗原在GVHD、GVL反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用。其他抗原，如腫瘤特異性抗原PML/RARα、bcr/ab1等也參與了GVL反應(yīng)，但這些抗原介入的反應(yīng)對臨床GVL效應(yīng)有何影響尚難以評價。最近的一些臨床和動物實驗資料表明不同亞群T細胞在GVL與GVHD中起不同作用；CD4細胞對GVL效應(yīng)尤為重要，因為選擇性去除CD8亞群T細胞（保留CD4細胞亞群）的移植，能有效降低GVHD發(fā)生率且并不影響抗白血病效應(yīng)。此外，自然殺傷細胞也參與GVL反應(yīng)［18～20］。雖然GVL和GVHD之間的關(guān)系尚未闡明，臨床資料提示二者并非完全一致。最近的小鼠動物試驗中，發(fā)現(xiàn)GVL、GVHD二者在淋巴細胞分布動力學、細胞組成亞群及巨噬細胞表面抗原表達方面，均有明顯差異。證明了二者在細胞乃至分子水平確是兩種不同的過程。隨著對兩者免疫機制的進一步研究，必將給更好的應(yīng)用GVL效應(yīng)奠定理論基礎(chǔ)［21］。
7 排斥
雖然對HLA相合的臍血干細胞移植而言排斥并不構(gòu)成臨床的主要問題，但對于HLA不合的臍血干細胞移植，由于跨越的免疫屏障較大，且常采用去除供者T細胞的方式進行移植，排斥就轉(zhuǎn)化為主要矛盾。排斥的機制一般認為是由于殘留的受者T細胞識別供者抗原并發(fā)生免疫反應(yīng)所致。供者T細胞由于可以抑制受者殘存的T細胞而有促進植活之功能。近年對供者移植物中促進植活的不同細胞成份研究取得一定進展。動物模型表明，表達TCRαβ受體的細胞是促進植活的主體細胞。而表達TCRγδ的細胞具有促進細胞植活卻不引起GVHD的功能，可用于HLA不合的移植。CD8+T細胞同樣對促進植活起重要作用。進一步研究顯示，其亞群Tc2是促進植活的主體細胞，且不引起嚴重GVHD［22~24］。
總之，異基因臍血造血干細胞移植是當今免疫治療的熱點，免疫耐受和免疫反應(yīng)是其核心。隨著對移植免疫反應(yīng)的細胞分子機制的進一步深入研究，我們完全有可能在不遠的將來建立全新的免疫耐受模式，在受惠于臍血干細胞移植帶來的免疫治療的益處的同時免受其合并癥之苦，并最終跨越HLA不合的免疫屏障，將血液惡性腫瘤的治療推向一個新的時代。
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基因工程制藥綜述范文第4篇
關(guān)鍵詞：藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范；藥品；發(fā)展；綜述
一、概述
藥品的生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(Good Manu-facturing Practice，GMP)是一種特別注重在藥品生產(chǎn)過程中實施對其質(zhì)量與衛(wèi)生安全的自主性制度；是對公眾安全、有效用藥的保證，是血的經(jīng)驗教訓的結(jié)晶。藥品GMP要求藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具備良好的生產(chǎn)設(shè)備，合理的生產(chǎn)過程，完善的質(zhì)量管理和嚴格的檢測系統(tǒng)，確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量(包括藥品安全衛(wèi)生)符合法規(guī)要求。
二、產(chǎn)生的背景
讓我們先一起回顧一下藥品GMP發(fā)展簡史。1902年前，有12名以上兒童因使用被破傷風桿菌污染的白喉抗毒素而死亡。1922～1934年，有2000多人死于使用氨基比林造成的粒細胞缺乏的相關(guān)疾病。1935年，有107人死于二甘醇代替酒精生產(chǎn)的口服磺胺制劑。1941年，一家公司生產(chǎn)的磺胺噻唑片被鎮(zhèn)靜安眠藥苯巴比妥污染，致使近300人死亡或受傷害。1955年，一家公司預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎疫苗生產(chǎn)過程中未能將一批產(chǎn)品中的病毒完全滅活，導致約60人感染病毒而患病。六十年代，反應(yīng)停事件導致歐洲1000例以上的嬰兒嚴重畸形。因此，美國政府不斷加強對藥品安全性的控制力度。1963年美國藥品食品監(jiān)督管理局(FDA)頒布了世界上第一部《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》。由此，藥品GMP誕生了!藥品GMP誕生后顯示了強大的生命力，并在世界范圍內(nèi)迅速推廣。1969年世界衛(wèi)生組織(WHO)頒發(fā)了自己藥品GMP，并向各成員國推薦，1971年，英國制訂了《GMP》(第一版)，1972年，歐共體公布了《GMP總則》指導歐共體國家藥品生產(chǎn)。1982年我國臺灣地區(qū)開始強制推行藥品GMP。1988年，東南亞國家聯(lián)盟制訂了自己的藥品GMP。同年，我國第一部法定的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)也由中華人民共和國衛(wèi)生行政部門頒布。
三、在我國的發(fā)展
根據(jù)我國的基本國情，藥品GMP的指導思想在于對藥品生產(chǎn)全過程的控制管理，以達到藥品安全、穩(wěn)定和有效的目的。在我國，頒布藥品GMP實際上已經(jīng)有二十年了。
最初，我國引進藥品GMP的概念是在20世紀80年代，這個階段是我國推行藥品GMP的初始階段，也是一個初步學習和認識的階段。在這個階段，國內(nèi)絕大多數(shù)藥品生產(chǎn)企業(yè)都認為事不關(guān)己；只有極少數(shù)條件好的企業(yè)，在嘗試著進行，且多少有點標新立異的味道。這段時間內(nèi)，藥品GMP的推行也非常困難。
1982年，中國醫(yī)藥工業(yè)公司在總結(jié)國內(nèi)企業(yè)實施藥品GMP初步經(jīng)驗基礎(chǔ)上，制訂了《藥品生產(chǎn)管理規(guī)范(試行)》，在制藥行業(yè)中試行、推廣。
1985年第一部藥品管理法中明確了“藥品生產(chǎn)企業(yè)必須按照國務(wù)院衛(wèi)生行政部門制定的《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，制定和執(zhí)行保證藥品質(zhì)量的規(guī)章制度和衛(wèi)生要求。”這是我國第一次從法律的高度提出藥品GMP，其中也明確了藥品GMP的宗旨是保證藥品質(zhì)量。
1988年3月，衛(wèi)生部了《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》，中國的第一部藥品GMP宣告誕生。
1992年，中華人民共和國衛(wèi)生部參照國際慣例，又一次對1988年制定的《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》進行了修訂，頒布了1992年修訂的《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》，也就是我國法定的第二版藥品GMP。我國醫(yī)藥行業(yè)掀起了實施藥品GMP的。
1995年至1997年，經(jīng)國家技術(shù)監(jiān)督局批準，成立了中國藥品認證委員會，開始接受企業(yè)的藥品GMP認證申請并開展認證工作。與此同時原國家醫(yī)藥管理局先后制訂了《粉針劑實施指南》、《大容量注射液實施指南》、《原料藥實施指南》和《片劑、硬膠囊劑、顆粒劑實施指南和檢查細則》等指導文件，并開展了粉針劑和大容量注射液劑型的藥品GMP達標驗收工作。
1998年國家藥品監(jiān)督管理局的成立，開啟了實施藥品GMP的新紀元。同年修訂了《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》(GMP)，制訂了藥品GMP的附錄，使得我國的藥品GMP實施在同國際接軌的基礎(chǔ)上，更具有可操作性。
1999年6月，又修訂了的《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》(1998年修訂)，并對粉針劑、注射劑、基因工程產(chǎn)品、仿制藥強制實施藥品GMP時限分別作了規(guī)定。
2001年通過的修訂的《藥品管理法》將藥品GMP以法律的形式加以規(guī)定，其修訂為按照藥品GMP組織生產(chǎn)，對企業(yè)要按照藥品GMP進行認證，認證合格的發(fā)證書，由指導性的規(guī)定轉(zhuǎn)為強制性的實施。這再一次掀起了藥品GMP認證的。
2003年7月1日，為強制性實施藥品GMP認證，要求所有未達到藥品GMP要求的藥品制劑和原料藥生產(chǎn)車間全部停產(chǎn)，這是一項非常艱難的工作。僅山東省就有50多家達不到藥品GMP要求的企業(yè)實現(xiàn)了停產(chǎn)或部分停產(chǎn)。
2004年6月30日，我國境內(nèi)所有上市藥品制劑(包括原料藥)都實現(xiàn)了按藥品GMP要求生產(chǎn)。
2006年1月1日起所有按藥品管理的體外生物診斷試劑實現(xiàn)了按藥品GMP要求生產(chǎn)。
2007年1月1日起所有醫(yī)用氣體實現(xiàn)了按藥品GMP要求生產(chǎn)。
2008年1月1日起所有中藥飲片也實現(xiàn)了按藥品GMP要求生產(chǎn)。
四、在我國取得的成效
從引進藥品GMP這個概念到推行藥品GMP認證，目前我們已取得了階段性成果。通過推行藥品GMP，提高了我國制藥企業(yè)的管理水平和藥品質(zhì)量；絕大多數(shù)企業(yè)新建了生產(chǎn)廠房或?qū)υ瓘S房進行了改造。有95％以上的生產(chǎn)設(shè)備得到了更新?lián)Q代，生產(chǎn)自動化水平不斷提升，產(chǎn)品質(zhì)量明顯提高。改變了我國藥品生產(chǎn)企業(yè)原來的多、小、散、亂的狀況。在完善硬件更新改造的同時，逐步建立了系統(tǒng)性的管理軟件，提高了企業(yè)管理人員和職工的專業(yè)素質(zhì)和質(zhì)量意識，實施藥品GMP已成為藥品生產(chǎn)企業(yè)生存的必備條件。
基因工程制藥綜述范文第5篇
【摘要】 本文介紹了藥用植物麻黃的生物學特征、化學成分及內(nèi)生菌的研究概況，并對麻黃的多元價值及資源現(xiàn)狀進行了綜述。
【關(guān)鍵詞】 麻黃;生物學特征;化學成分;內(nèi)生菌;資源
麻黃為常用中藥，源于麻黃科植物草麻黃(Ephedra sinica Stapf)、木賊麻黃(E. equisitina Bunge)、中麻黃(E. intermedia Schrenk ex Mey)的干燥草質(zhì)莖。始載于漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，歷代本草均有記載。其性味辛、微苦、溫，歸肺、膀胱經(jīng)。具有發(fā)汗解表，宣肺平喘，利水消腫等功效。主治風寒感冒、發(fā)熱無汗、咳嗽氣喘、骨節(jié)疼痛、風水浮腫、小便不利、風邪頑痹、風疹瘙癢等癥[1]。現(xiàn)代醫(yī)學和中醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)其具有平喘、抗病毒作和免疫調(diào)節(jié)作用。麻黃主要分布于我國北方干旱、半干旱地區(qū)，具有重要的藥用、生態(tài)和經(jīng)濟價值。
1 麻黃資源狀況
1.1 生物學特點 麻黃呈灌木、半灌木、亞灌木或草本狀，莖直立或匍匐，分枝多，一般是雌雄異株，少有同株。雄花單生或數(shù)個叢生，具膜質(zhì)假花被;雌花具4對苞片，種子1～3 粒，胚乳豐富，肉質(zhì)或粉質(zhì)，子葉兩枚，發(fā)芽時出土[2，3]。
1.2 生長習性 麻黃屬旱生植物，適宜于溫涼、干燥的氣候環(huán)境，耐旱性強，較耐貧瘠，多分布于海拔800～1500m的開敞、干燥、多石的山坡和山前地帶及丘陵坡地、平川、沙地， 在沙地上常有聚生的小片群落。對土壤要求為微堿性， 特別是富含有機質(zhì)的沙質(zhì)土壤。在年均氣溫9℃～15℃，年降雨量300～500mm的地區(qū)最為適宜[4]。
1.3 地理分布 麻黃屬現(xiàn)存約67種，中國有15種及2變種1變型[5]，約占全世界麻黃屬植物總數(shù)的50%[6]，主要分布在我國北方地區(qū)的北緯35°～49°范圍內(nèi)， 其地理分布主要受降水的制約， 多集中分布于降水量350mm以下、年濕潤度0.38以下的干旱、半干旱地區(qū)[7]。草麻黃主要分布于新疆吐魯番、甘肅河西地區(qū)、內(nèi)蒙古;木賊麻黃主要分布于河北、山西、內(nèi)蒙古、陜西西部、甘肅、青海、新疆;中麻黃主要分布于內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、河北、山東、山西、陜西、甘肅、青海、新疆等地[7，8]。
2 麻黃的化學成分
麻黃具有多種類型的化學成分，包括生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油類、糖類、鞣質(zhì)及有機酸類、氨基酸及礦質(zhì)元素類等。
2.1 生物堿類 麻黃類生物堿中麻黃堿的含量較高，為苯丙胺類生物堿，該類成分一直以來被認為是麻黃的有效成分，至今已分離出10多種麻黃堿，但在不同種麻黃中其含量從1%～3%不等[9]。草麻黃中以麻黃堿為主，偽麻黃堿含量較少，總堿含量為0.481%～1.382%;木賊麻黃中總堿含量為2.093%～2.436%;中麻黃總堿含量為1.059%～1.564%[10]。
2.2 揮發(fā)油類 麻黃所含揮發(fā)油類成分復(fù)雜，主要有效成分有2，3，5，6-四甲基吡嗪(2， 3-tetram-ethylpyrazine)和1-α-萜品烯醇(1-α-terpineol)，但含量很低。草麻黃含油量0.25% ，木賊麻黃0.124%;草麻黃揮發(fā)油中有效成分四甲基吡嗪和萜品烯醇的含量分別為2.26%和1.92%，而木賊麻黃揮發(fā)油中僅含四甲基吡嗪1.34%[9，10]。
2.3 黃酮類 黃酮是麻黃屬中的一類重要成分，李姿嬌等研究發(fā)現(xiàn)麻黃的總黃酮含量約為0.29%[11]。麻黃黃酮類主要有: 芹菜素(Apigenin)、山柰酚(Kaempferol)、槲皮素(Quercetin)、無色矢車菊素(Leuoc-ycmidin)、小麥黃素(Tricin)、草棉黃素(Herbacetin)、芹菜素-5-鼠李糖苷(Apigenin-5-rhamno-side)、3-甲氨基棉黃素(3-Methoxyherbacetin)、山柰酚鼠李糖苷(Kaempferolrhsmnoside)、無色飛燕草素(Leu-codelphinidin)、蘆丁(Rudin)、白天竺秦苷(Leu-copelargonin)、白花色甙(Leucoanthpcyanin)、4，5，7-三羥基-8-甲氧基黃酮醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(4，5，7-Trihy-Droxy-8-methoxy-flaronol-flaronol-3-O-β-D-glucopyraniside)。
2.4 多糖類 多糖在不同的麻黃中各有不同，目前國內(nèi)主要對麻黃果多糖進行了研究。麻黃草質(zhì)莖及其果實中多糖的含量分別為1.05%和7.21%，水溶性糖含量分別為1.93%和1.158%，果實中還原性糖及水溶性糖的含量均比草質(zhì)莖中的高。據(jù)報道從雙穗麻黃中分離出具有降血糖功能的麻黃多糖A、B、C、D、E[9]。采用熱水提取法，從麻黃中提取到水溶性多糖，其收率為2.8%左右。經(jīng)SephadexG-100柱層析得到較純的麻黃多糖樣品，實驗證明，該樣品具有清除氧自由基的作用[12]。
2.5 鞣質(zhì)及有機酸 鞣質(zhì)也是麻黃屬植物中的一類重要化學成分，一般認為其主要是以縮合型鞣質(zhì)形式存在[9，13]。現(xiàn)已分出兒茶酚鞣質(zhì)等26種縮合鞣質(zhì)，最近又報道分出可水解型鞣質(zhì)nilocitin，麻黃鞣質(zhì)A 和B(ephedratannin A、B)[10]。對于麻黃中的有機酸成分研究較少，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的有機酸有苯甲酸、香草酸、肉桂酸、香豆酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸和原兒茶酸等。
2.6 氨基酸及礦質(zhì)元素 麻黃果有一定的營養(yǎng)及食用價值，研究結(jié)果顯示麻黃果富含18種氨基酸及較高的半必需氨基酸和非必需氨基酸[9]。
3 麻黃資源的多元價值
3.1 藥用價值 麻黃是馳名中外的一種傳統(tǒng)藥材，也是提取麻黃素的主要原料，其主要成分為麻黃堿和偽麻黃堿，二者作為擬腎上腺素藥物被廣泛應(yīng)用于多種制劑中。《中國藥典》2010年版收載作為藥用的麻黃植物主要有木賊麻黃、草麻黃和中麻黃。麻黃味辛、微苦，性溫、歸肺、膀胱經(jīng)，具有發(fā)汗散寒，宣肺平喘，利水消腫功能。用于風寒感冒，胸悶喘咳，風水浮腫，支氣管哮喘。在畜牧上麻黃可提高牲畜的抗病能力[7]。以麻黃堿為主的制劑在國外還有營養(yǎng)補充劑、減肥劑等[14，15]。
3.2 生態(tài)價值 麻黃是重要的荒漠旱生植物，具有耐寒、耐旱、耐貧瘠、耐沙埋等特性。麻黃草根系發(fā)達、分蘗能力強、根幅寬， 地上部分可以增加地表覆蓋度，多生長在沙丘黃土丘陵，對防止水土流失、保護草場、改善沙地生態(tài)環(huán)境等發(fā)揮著巨大作用[16]。有研究表明有麻黃分布的沙丘地段， 植被總覆蓋度可提高32%; 同時， 麻黃也是珍貴的水土保持植物， 在28°的坡地上， 麻黃群落比禾草群落生長的地段徑流量減少47%，沖刷量減少60%。
3.3 飼用價值 麻黃具有一定的飼用價值， 其所含粗脂肪和粗蛋白屬于中等牧草類型。經(jīng)測定，未提取麻黃素的麻黃營養(yǎng)成分中粗蛋白和粗脂肪含量分別為8.34%和3.2%;提取麻黃素后的麻黃草渣成分中粗蛋白和粗脂肪含量分別為1.98%和3.58%。麻黃植物的上芽及枝條冬天呈綠色， 植物體保持良好狀態(tài)， 可成為牲畜冬季采食的主要牧草。由于麻黃生長在荒漠、半荒漠草場上， 常與蒿子、假木賊、琵琶柴、裸果木、木旋花、紅柳等植物構(gòu)成春秋草場， 是春、秋季節(jié)牲畜轉(zhuǎn)場的主要放牧草場。另外，工廠中提取過麻黃素堿的草渣，在冬、春季節(jié)牧草青黃不接時， 也可以和其他飼料混用， 增加飼料來源。4 麻黃內(nèi)生菌的研究概況
內(nèi)生菌是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部， 如根、莖、葉、花、果實和種子，而不使寄主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀(至少暫時沒有感染癥狀)的微生物，主要有細菌、真菌和放線菌[17]。部分植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與寄主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)。近年來，隨著對藥用植物內(nèi)生菌的研究不斷深入，麻黃內(nèi)生菌的研究也有一定進展。古力山·買買提等為篩選具有拮抗活性的植物內(nèi)生菌，以新疆有毒植物藍麻黃(E.glauca)為材料，采用研磨法和瓊脂擴散法從中分離并篩選出一株對多種植物致病菌具有較強抗性的內(nèi)生細菌XJEG-GB-13。根據(jù)該菌形態(tài)特征、生理生化特性和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，菌株XJEG-GB-13應(yīng)屬于枯草芽孢桿菌屬。拮抗作用測定結(jié)果表明，內(nèi)生細菌XJEG-GB-13發(fā)酵液對8種植物病原菌具有較強的抑制作用[18]。古力山·買買提等又從藍麻黃中分離得到7株內(nèi)生放線菌，而其中的XJEG-GA-6對7種植物病原菌具有較好的拮抗作用，尤其是對玉米大斑病菌的拮抗作用顯著抑菌圈大于20mm，并且在該菌株的代謝產(chǎn)物中檢測出生物堿成分[19]。黃丹虹等[20]以內(nèi)蒙古赤峰等地產(chǎn)的麻黃為材料，進行植物內(nèi)生真菌的分離、純化，得到141株內(nèi)生真菌，體外抗氧化、抗腫瘤等活性測定表明，有11株內(nèi)生真菌對H2O2具有較好的清除活性，占菌株總數(shù)的7.8%;有27株內(nèi)生真菌對Raji和Hep G22具有腫瘤細胞毒活性，占菌株總數(shù)的19.15%，其中以抑制懸浮Raji細胞為主。此外，在141株菌中，有74株對一種或二種以上的指示菌顯示出抑菌活性，占菌株總數(shù)的52.48%。該實驗結(jié)果表明，麻黃中含有豐富的內(nèi)生真菌，是抗氧化/抗菌及抗腫瘤等活性物質(zhì)的重要來源，為進一步從中草藥植物中分離篩選新藥先導化合物提供了科學依據(jù)。彭輝等采用常規(guī)的分離純化方法從麻黃草質(zhì)莖中分離出5種內(nèi)生真菌，經(jīng)初步篩選得到可能產(chǎn)生生物堿的菌株Mh3和Mh5。進一步研究表明，Mh5為能產(chǎn)生麻黃生物堿類物質(zhì)的內(nèi)生真菌[21]，這些對進一步了解植物-內(nèi)生真菌的相互關(guān)系、開發(fā)我國植物內(nèi)生真菌的藥用資源以及瀕危藥用植物的生態(tài)保護等均具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。
我國是全球天然麻黃的最大產(chǎn)地，也是世界上主要生產(chǎn)麻黃素的國家。隨著制藥業(yè)的發(fā)展，國內(nèi)外對麻黃資源的需求不斷增加[22]。目前，每噸麻黃堿的生產(chǎn)需要消耗200～300噸的麻黃草，每公頃麻黃產(chǎn)量為15噸左右，一個50噸麻黃堿的生產(chǎn)廠家，每年約需1000公頃的麻黃。長期以來，麻黃的加工原料主要依賴采收野生資源，導致植被破壞嚴重，產(chǎn)量和品質(zhì)逐年下降。2000年起，我國開始禁止濫挖發(fā)菜、甘草、麻黃草等固沙植物，在19個省、市、自治區(qū)全面啟動天然林保護工程[7]。為了保護現(xiàn)有的天然資源，在采收麻黃草時要求留有母株，禁止連根采挖。現(xiàn)在人們正利用各種不同的方法如組織培養(yǎng)[22，23]、化學合成[24]、生物轉(zhuǎn)化法[25]、轉(zhuǎn)基因微生物發(fā)酵等[25]方法開發(fā)麻黃資源。利用細胞懸浮培養(yǎng)提取次級代謝產(chǎn)物的優(yōu)點是不受環(huán)境生態(tài)和氣候條件的限制，增殖速度比整個植物體栽培快，且有用物質(zhì)的含量一般較高，但在生產(chǎn)工藝、細胞株遺傳穩(wěn)定性和成本等方面仍存在問題。生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快、轉(zhuǎn)化率高、得到的產(chǎn)品純度高等優(yōu)點，但是麻黃堿的生產(chǎn)最終依賴苛刻的化學條件來實現(xiàn)，造成生產(chǎn)成本較高，是制約生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)麻黃堿的主要原因。轉(zhuǎn)基因微生物發(fā)酵法是通過對生物轉(zhuǎn)化法中關(guān)鍵酶的研究，利用轉(zhuǎn)基因微生物或通過純化得到大量酶來生產(chǎn)麻黃堿的一種方法，也是基因工程技術(shù)發(fā)展的必然結(jié)果。顯然，利用生物技術(shù)開發(fā)麻黃資源將是未來的發(fā)展方向。
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