十八大感想

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十八大感想范文第1篇

【關鍵詞】  靶向線粒體轉錄因子a·rna干擾·慢病毒載體·模型，動物·大鼠，wistar

establishment of experimental aminal model of rnai in vivo using lentivirus-sirna vector system targeting tfam

lin heng, tang chun, wu qiao, feng chun-lin, zhang yu-jun, bie ping

hepatobiliary surgery institute, southwest hospital, third military medical university （chongqing 400038, china）

【abstract】 objective: to construct a recombinant lentivirus vector of rna interference targeting mitochondrial transcription factor a （tfam） gene and to select the most efficient small interfering rna （sirna） to suppress tfam in target cells, and  to use the selected lentivirus vector in vivo and to analyze its efficacy. methods: according to genbank information of tfam, four sirna and double strand dna were designed, synthesized and inserted into the lentivirus vector. the recombinant lentivirus vector system was confirmed by pcr and sequencing, then it was used to transfect the target cells. the change of tfam expression was determined by pcr and western blot. the most efficient lentivirus vector was selected and used in vivo. the change of tfam expression in liver was assessed. results: the results of enzyme digestion and sequencing showed that the recombinant lentivirus vector was constructed successfully. the result of rt-pcr showed that target 3#  had the highest interfering. efficiency （about 55%） and western blot analysis confirmed its efficacy. the result of rnai in vivo also proved its efficiency. conclusion: the recombinant lentivirus vector of rna interference targeting tfam has been successfully constructed. it can effectively suppress tfam expression in vitro and in vivo.

【key words】 mitochondrial transcription factor a·rna interference·lentiviral vector·rats,wistar

rna干擾（rna interference，rnai）可用于生物學研究和藥物研制，并可作為疾病的一種治療手段。現已發現一些有治療作用的sirna［1］，但sirna如何有效地進入體內并傳遞到合適的靶器官和靶細胞尚不明確，文獻報道，用于活體內傳遞sirna的方法包括化學修飾形成共軛體（如脂質體）［2］、與多肽、聚合物或抗體結合形成復合物［3］以及用病毒作為載體等。

本研究設計合成靶向線粒體轉錄因子a（mitochondrial transcription factor a，mttfa，tfam）的sirna，并利用慢病毒載體系統將體外實驗篩選出的有效sirna通過門靜脈傳輸至大鼠肝臟，觀察其體內的干擾活性，從而構建出大鼠活體rna干擾實驗動物模型，為下一步實驗研究打下堅實的基礎。

1　材料與方法

1.1　動物來源及分組

健康wistar大鼠由第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供，雌雄不限，體質量180～250 g。動物分為陽性病毒組（實驗組）、陰性病毒對照組和生理鹽水對照組。

1.2　實驗材料

慢病毒包裝細胞293t細胞株、大腸桿菌菌株dh5α、及大鼠肝星狀細胞株（hsc－t6）均由上海吉凱基因技術有限公司提供；慢病毒載體系統由pgc－lv載體、phelper1.0載體和phelper2.0載體3種質粒組成。taq多聚酶購自日本takara公司；lb培養基購自美國atcc公司；大量質粒dna抽提試劑盒購自美國qiagen公司；限制性內切酶ageⅰ、ecorⅰ、t4 dna連接酶及其緩沖液均購自美國neb公司；m-mlv逆轉錄酶、dntp、rna酶抑制劑均購自美國promega公司；pcr用試劑、引物購自上海吉凱基因技術有限公司；胰酶購自上海化學試劑公司；胎牛血清、dmem、rpmi1640及opti－mem均購自美國gibco公司；脂質體lipofect2000、總rna提取試劑trizol均購自美國invitrogen公司；山羊抗tfam、小鼠抗gapdh、抗山羊igg、抗小鼠igg均購自美國santacruz公司；bca protein assay kit購自美國hyclone-pierce公司；ecl-plus/kit購自美國amersham公司。

1.3　方法

1.3.1　構建慢病毒載體

針對目的基因tfam的基因序列，利用公用網站按照rna干擾序列的設計原則，設計了4個sirna的寡核苷酸序列（命名為target1#、target2# 、target3# 和target4#，具體序列見表1），并進行慢病毒載體的構建（雙鏈dna具體序列見表2），然后運用t4連接酶與經過限制性內切酶ageⅰ、ecorⅰ雙酶切后的pgc－lv載體連接，用氯化鈣法制備新鮮的大腸桿菌感受態細胞，轉化大腸桿菌菌株dh5α，最后挑取陽性克隆進行pcr鑒定并進行測序分析。pcr鑒定陽性克隆的引物信息如下：上游引物：5’-cctatttcccatgattccttcata-3’，下游引物：5’-gtaatacggttatccacgcg-3’。

1.3.2　慢病毒載體包裝及滴度測定

產毒細胞為293t細胞，將合成好的4個重組慢病毒質粒及輔助包裝載體質粒進行高純度無內毒素抽提，按照lipofectamine2000使用說明共轉染293t細胞。轉染8 h后更換為完全培養基，48 h后收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液進行濃縮和收獲，將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，－80 ℃長期保存。取其中1支進行病毒生物學滴度測定，方法為孔稀釋法。具體病毒濃縮收獲及滴度測定實驗步驟參考文獻[4]。

1.3.3　慢病毒感染目的細胞hsc－t6

將處于對數生長期的靶細胞進行胰蛋白酶消化，制成細胞懸液（細胞數約為2×104），接種于12孔培養板中，37 ℃、5%co2 培養箱培養待細胞融合度達到約30%；根據moi值（moi=10，moi表示病毒數與細胞數量的比值），加入適宜量的病毒，12 h后觀察細胞狀態。如果沒有明顯的細胞毒性作用，繼續培養24 h后更換培養基；如果有明顯的細胞毒性作用，立即更換培養基；感染3 d后觀察慢病毒上報告基因gfp的表達情況，感染效率>50%者繼續培養，待感染時間達到5 d后收集細胞抽提rna進行rt-pcr檢測實驗，感染7 d后收集細胞并采用western blot的方法檢測目的基因蛋白水平的表達；感染效率<50%的實驗組，重新進行感染實驗。實驗分為6組：con為正常目的細胞，未感染任何病毒的細胞組，nc為正常目的細胞，加陰性對照病毒感染的細胞組，kd為正常目的細胞，加rnai靶點病毒感染的細胞組，1～4標示待篩選靶點病毒的序號。

1.3.4　目的細胞中tfam rnai效果檢測

1.3.4.1　rt－pcr檢測目的細胞tfam mrna水平表達的變化情況

取各組細胞用trizol法抽提總rna，然后根據promega反轉錄試劑盒的操作說明將rna反轉錄成cdna。取1μl作為模板進行pcr反應，tfam上游引物：5’-agaaacgcctaaagaagaaagc-3’，下游引物：5’-ttccaagcctgatttacaagc-3’，擴增產物166 bp；內參照actin上游引物：5’-cggcattgtcaccaactg-3’，下游引物：5’-cgctcggtcaggatcttc-3’，擴增產物約369 bp。pcr反應條件：預變性95 ℃、15 s，之后每一步變性95 ℃、5 s，退火延伸60 ℃、30 s；共進行45個循環，每次在延伸階段讀取吸光度值。制作熔解曲線：pcr結束后，95 ℃變性1 min，然后冷卻至55 ℃，使dna 雙鏈充分結合。從55 ℃開始到95 ℃，每一步增加0.5 ℃，保持30 s, 同時讀取吸光度值。real-time pcr數值分析采用2-δδct分析法。

1.3.4.2　western blot檢測目的細胞tfam蛋白水平表達的變化情況

用2×lysis buffer（裂解液）冰上裂解細胞10～15 min，裂解液配方如下：1 mol/l tris-hcl（ph=6.8）100 mm、巰基乙醇 2％、甘油20％及sds 4％。測定蛋白濃度后，將每個樣品蛋白終濃度均調整為2 g/l。各組取相同量總蛋白，采用sds-page電泳法電泳，濕轉至pvdf膜，用含5％脫脂牛奶的tbst溶液封閉pvdf膜，山羊抗tfam抗體（1∶200）、小鼠抗gapdh抗體（1∶5 000）與封閉好的pvdf膜室溫孵育2 h，tbst洗膜，相應二抗（1∶5 000）室溫孵育pvdf膜2 h，tbst洗膜，最后采用ecl法進行顯色。利用圖像處理軟件quantity one4.62對蛋白電泳圖片進行分析，分別測定目的蛋白條帶和內參照的吸光度值，并以二者的比值作為目的蛋白的相對定量結果。

1.3.5　大鼠活體rnai動物模型的建立

擬通過門靜脈將慢病毒載體注入大鼠肝臟，為了保證慢病毒在大鼠體內的感染效率，我們在注射慢病毒之前進行了全肝血流阻斷并參考文獻[5]的做法將阻斷時間定為20 min。具體方法如下：

1）實驗組大鼠腹部用8％na2s脫毛，手術野用碘伏消毒，整個手術過程在雙人雙目顯微鏡下操作。進行全肝血流阻斷時，先結扎右腎上腺靜脈，然后依次阻斷肝后下腔靜脈、肝動脈和門靜脈的血流，全肝血流阻斷后立即通過門靜脈注射rna干擾慢病毒載體（5×107 tu/只），阻斷20 min后恢復血流。

2）陰性病毒對照組和生理鹽水對照組手術步驟基本上和實驗組相同，不同的是門靜脈分別注射的是陰性對照病毒和生理鹽水。

所有實驗動物術前禁食12 h，麻醉采用乙醚吸入麻醉，術后自由進食水。各組觀察時相點為術后4、7、14 d，保證每時相點每組存活大鼠6只。

1.3.6　目的基因tfam活體rnai效果檢測

1.3.6.1　肝組織細胞感染慢病毒

術后各時相點取大鼠肝臟組織，制成1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小的組織塊，用oct包埋劑包埋后反復多次于液氮中凍存（每次凍存時間為3～5 s），直至組織標本和包埋劑一起凍存成形，置于－80 ℃保存備用；將包埋好的標本切片，厚度為7 μm，置－20 ℃保存；切片取出后風干半小時，然后置于－20 ℃預冷的丙酮中4 ℃固定8 min；pbs洗3次，5 min /次；甩去多余的水分，dapi（1∶100）染核，水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察肝組織細胞感染情況。

1.3.6.2　rt－pcr檢測肝組織中tfam mrna水平表達的變化情況

取各組液氮保存的肝組織標本，玻璃勻漿器制成勻漿后用trizol法抽提組織總rna，將rna反轉錄成cdna。取1 μl作為模板進行pcr反應。tfam上游引物：5’-taccctcgcctgtcagccttatct-3’，下游引物：5’-cacttcgcccaacttcagccattt-3’，擴增產物597 bp；內參照β-actin上游引物：5’-atcatgtttgagaccttcaaca-3’，下游引物：5’-catctcttgctcgaagtcca-3’，擴增產物約318 bp。pcr反應條件基本同前。real-time pcr數值分析采用2-δδct分析法。

1.3.6.3　western blot檢測肝組織中tfam 蛋白表達的變化情況

取100 mg液氮保存的肝組織，加入1 ml ripa和10 μl pmsf（不能預先加入到ripa中，否則pmsf失去效能）冰上研磨組織塊，研磨時避免起泡沫和發熱；將樣品轉移至1.5 ml離心管，4 ℃、2 000 r/min離心30 min；將上清小心轉移到無菌離心管中，取部分測定蛋白濃度，其余-20 ℃ 保存備用。其余實驗步驟及分析方法基本同前。

2　結果

2.1　陽性克隆的pcr鑒定

靶向tfam的shrna寡核苷酸序列經退火形成雙鏈dna，與經過限制性內切酶ageⅰ、ecorⅰ雙酶切后的pgc－lv載體連接，連接產物轉化dh5α大腸桿菌，挑取陽性克隆進行pcr鑒定。陽性克隆pcr產物大小為343 bp，而空載組pcr產物大小為306 bp，鑒定結果與預期一致。測序結果顯示4個靶點均插入正確（圖1，2）。2.2　慢病毒包裝及滴度測定　使用重組慢病毒載體pgc-lv和慢病毒包裝質粒phelper1.0和phelper2.0共轉染293t細胞，48 h后收集病毒粗提液進行濃縮，命名為lenti-target1#、lenti-target2#、lenti-target3#和lenti-target4#。然后利用孔稀釋法分別測定4個靶點的病毒滴度，結果依次為8×107、7×107、9×107和1×108 tu/ml，病毒包裝成功符合下一步需要。

2.3　體外目的細胞中tfam rnai效果檢測

2.3.1　rt－pcr檢測目的細胞中tfam的干擾效果

rt－pcr結果顯示，各組目的細胞tfammrna相對表達量（2-δδct）分別為，con：0.794±0.016；nc：1.002±0.075；kd1：0.853±0.063kd2：0.913±0.149；kd3：0.465±0.052；kd4：0.899±0.071。4個靶點中3號靶點對目的基因tfam的表達有明顯干擾效果，干擾效率在55％左右（p<0.05）。

2.3.2　western blot檢測tfam蛋白水平的變化

western blot結果證實3號靶點病毒感染hsc-t6細胞后，tfam蛋白水平的表達明顯減弱，因此，該靶點是有效的rna干擾靶點（圖3，4）。

2.4　目的基因tfam活體內rna干擾結果

2.4.1　肝組織感染病毒情況

通過肝組織冰凍切片觀察到，門靜脈注射慢病毒4 d后，實驗組大鼠肝組織中就可以見到感染了慢病毒（帶綠色熒光）的肝組織細胞（細胞核為藍色，圖5）；一直到膽道再通術后14 d，第3組大鼠肝組織中都可以見到感染了慢病毒的肝組織細胞。對心、脾、肺和腎等其它組織器官的觀察可以發現這些組織細胞并沒有感染慢病毒。

2.4.2　肝組織中目的基因tfam mrna水平的變化

rt－pcr結果顯示，術后4 d，實驗組大鼠肝組織中目的基因tfam的表達較2個對照組明顯降低（p<0.05），干擾效率在45％左右，而兩個對照組之間差異無統計學意義。至術后2周，實驗組大鼠肝組織中tfam的表達仍然被明顯抑制（p<0.05），說明在體外合成篩選的慢病毒載體在大鼠肝組織中能夠較穩定的表達，并滿足下一步實驗的需要。

2.4.3　肝組織中目的基因tfam蛋白水平的變化

western blot結果顯示，門靜脈注射慢病毒后第4天，實驗組大鼠肝組織中tfam蛋白表達也出現明顯下降（圖6）；至術后2周，實驗組大鼠肝組織中tfam蛋白的表達仍然明顯低于兩個對照組，這一趨勢與rt－pcr的結果一致，證明慢病毒載體在實驗組大鼠肝組織中能夠穩定表達并保持了良好的干擾活性。

3　討論

tfam是影響線粒體dna（mitochondrial dna，mtdna）最重要的核編碼因子之一，在mtdna的表達調控中處于中心位置，是mtdna維持穩定和轉錄所必須的因子。對mtdna的作用主要有以下幾點：促進mtdna的轉錄及表達［6-7］；提高mtdna的拷貝數量［8］；修復受損的mtdna［9］；促進細胞的增殖及分化［10］。前期研究中發現，膽道梗阻后，重組人肝再生增強因子（recombinant human augmenter of liver regeneration，rhalr）對大鼠肝細胞線粒體功能及肝功能有明顯的保護作用；當膽道再通后，給予rhalr的大鼠，其肝功能及線粒體功能恢復更快［11］。通過進一步研究發現，rhalr發揮作用可能與tfam有關：膽道梗阻后，rhalr能夠降低tfam mrna表達量的下降；膽道再通后，rhalr能夠促進tfam mrna表達量的增加。因此，筆者推測rhalr可能通過誘導梗阻性黃疸大鼠肝細胞tfam的表達，提高線粒體dna的拷貝數，保護及修復損傷的線粒體dna，從而最終發揮其對阻塞性黃疸大鼠線粒體功能和肝功能的保護作用。為了證明此推測，我們在動物活體上進行tfam的rnai，觀察rhalr的保護作用是否依然存在。

sirna病毒載體系統中，常見的病毒載體有慢病毒、腺病毒和森林腦炎病毒等。其中慢病毒是逆轉錄病毒的一種，具有逆轉錄病毒的基本結構，但也有不同于逆轉錄病毒的組分和特性。利用慢病毒構建的sirna載體，與化學合成的sirna和基于瞬時表達載體構建的shrna相比，它可以用于感染依靠傳統轉染試劑難于轉染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態的細胞，并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組，進行長時間的穩定表達。基于下一步動物活體rnai實驗的需要，我們選擇了慢病毒作為sirna的載體。體外實驗結果顯示，3號靶點在mrna和蛋白水平上都能明顯降低tfam的表達，在設計的4個靶點中效率最高，達到了55％左右，且病毒滴度也滿足下一步實驗的需要。進一步動物實驗結果顯示，體外篩選出的有效干擾慢病毒載體通過門靜脈注入大鼠肝臟后4 d，通過觀察肝組織冰凍切片可以發現感染了慢病毒的肝臟細胞（其他組織器官中未發現表達綠色熒光的慢病毒），rt-pcr和western blot的結果也都提示目的基因tfam的表達明顯降低，干擾效率在45％左右；至術后2周時，實驗組大鼠肝組織中目的基因tfam的表達仍然明顯低于2個對照組。結果說明，以慢病毒作為載體將sirna通過門靜脈途徑傳輸到肝臟后保證了其感染的特異性，體外篩選出的有效干擾靶點在體內同樣保持了較好的干擾效果。因此，本實驗篩選出的靶向tfam的有效sirna序列，構建的慢病毒載體傳輸系統及建立的大鼠活體rnai動物模型，為下一步研究rhalr保護阻塞性黃疸大鼠肝功能的作用機制打下了堅實的基礎；同時，也為其他需要將tfam作為研究對象進行rnai的研究提供了參考。

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