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摘要:目的制定柴胡藥材中柴胡皂苷a、d的含量測定方法。方法用高效液相色譜蒸發光散射檢測法(HPLCELSD),AlltimaC18色譜柱,流動相甲醇水(80∶20),速度0.8ml・min1;蒸發光散射檢測器參數:漂移管溫度40℃,氣壓3.5bar。結果柴胡皂苷a和柴胡皂苷d分別在1.908~19.08μg(r=0.9996)和1.804~18.04μg(r=0.9992)范圍內線性關系良好,平均回收率分別為98.35%(RSD=1.26%)和97.64%(RSD=1.58%)。結論該方法簡便、靈敏、可靠、準確、重現性好,可作為柴胡藥材的質量控制方法。
關鍵詞:柴胡;高效液相色譜蒸發光散射檢測法;柴胡皂苷
DeterminationofSaikosaponina,dinRadixBupleuribyHPLCELSD
Abstract:ObjectiveTodeterminesaikosaponina,dinRadixBupleuribyHPLCELSD.MethodsHPLCELSDwasusedinthequantitativeanalysisbyusingAlltimaC18chromatographycolumnandmethanolwater(80∶20)asamobilephase.Theflowrateofmobilephasewas0.8ml・min1.Thetubetemperatureofthedetectorwas40℃.Thepressofpureairwas3.5bar.ResultsThelinearrangesforsaikosaponinaanddwere1.908~19.08μg(r=0.9996)and1.804~18.04μg(r=0.9992),theaveragerecoverieswere98.35%(RSD=1.26%)and97.64%(RSD=1.58%),respectively.ConclusionThismethodiseasy,sensitive,reliable,accurate,reproducibleandcanbeusedasthequalitycontrolmethodofRadixBupleuri.
Keywords:RadixBupleuri;HPLCELSD;Saikosaponin
柴胡藥材來源于傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根。為常用中藥,在我國已有2000多年藥用歷史,具有和解表里、疏肝、升陽之功效[1]。其主要有效成分為柴胡皂苷,其中柴胡皂苷a,d的活性較強,具有抗炎、保肝、降低血中膽固醇等藥理活性[2]。應用高效液相色譜法測定柴胡皂苷a,d含量的報道較多[3,4]。但由于檢測波長在210nm,雜質峰干擾十分嚴重,檢測靈敏度低,影響了含量測定的準確性。本文應用HPLCELSD法同時測定柴胡皂苷a,d的含量,其雜質峰干擾小,分離度好,靈敏度高,出峰時間短,便于操作。
1儀器與試藥
高效液相色譜儀:Agilent1100系統,SEDEX75型蒸發光散射檢測器;超聲波清洗機(中國華南超聲波設備廠),工作頻率25kHz,功率250w。柴胡皂苷a,d對照品購自中國藥品生物制品檢定所,含量測定用,批號分別為110777200303和110778200402;甲醇為色譜純(CALEDONLABORATORIESLSD.),水為重蒸水,其它試劑均為分析純;柴胡藥材經鑒定為柴胡BupleurumchinenseDC.的根。
2方法與結果
2.1色譜條件色譜柱為AlltimaC18(250mm×4.6mm,5μm);流動相:甲醇水(80∶20);速度0.8ml・min1,柱溫25℃;檢測器參數:漂移管溫度40℃,氣壓3.5bar。在選定的條件下,柴胡皂苷a、d對照品與樣品中其它組分色譜峰可基線分離,峰形好。按柴胡皂苷d峰計算,理論板數為3000以上。柴胡皂苷a,d對照品,供試品的高效液相色譜圖見圖1。
1.柴胡皂苷a2.柴胡皂苷da供試品圖譜b對照品圖譜
圖1高效液相色譜圖(略)
2.2對照品溶液的制備精密稱取柴胡皂苷a9.54mg和柴胡皂苷d9.02mg,置10ml量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得。
2.3供試品溶液的制備取柴胡藥材粉末(過60目篩)約1g,精密稱定,置25ml量瓶中,加入5%氨水甲醇20ml,超聲處理40min,放置至室溫,加5%氨水甲醇至刻度,搖勻,靜置,精密吸取上清液20ml置蒸發皿中,水浴蒸干,加甲醇溶解,置10ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續濾液作為供試品溶液。
2.4線性關系考察分別精密吸取柴胡皂苷a和d的混合對照品溶液2,5,10,15,20μl注入高效液相色譜儀中,分別測定柴胡皂苷a和d的峰面積。以峰面積自然對數值為縱坐標,進樣量的自然對數值為橫坐標,繪制標準曲線。柴胡皂苷a在1.908~19.08μg范圍內呈良好線性關系,回歸方程為Y=5.89721.5336X,r=0.9996;柴胡皂苷d在1.804~18.04μg范圍內呈良好線性關系,回歸方程為Y=5.86191.4965X,r=0.9992。
2.5精密度實驗精密吸取對照品溶液10μl,按上述色譜條件重復進樣5次,測定峰面積,結果柴胡皂苷a和d的RSD分別為1.18%和1.53%,表明儀器的精密度良好。
2.6穩定性實驗取樣品溶液,按含量測定方法及色譜條件分別置0,2,4,6,8h測定,結果柴胡皂苷a和d的RSD分別為1.29%和1.68%,表明樣品溶液在8h內穩定。
2.7重復性實驗精密稱取同批號樣品6份,按含量測定方法及色譜條件進行測定,結果樣品中柴胡皂苷a和d的平均含量分別為11.4541,8.3612mg・g1,RSD分別為1.34%和1.82%。
2.8回收率實驗采用加樣回收法,,取已知柴胡皂苷a,d含量的樣品6份,每份約0.5g,精密稱定,分別加入柴胡皂苷a對照品6.0544mg和柴胡皂苷d對照品4.4621mg,按含量測定方法及色譜條件進行測定,結果柴胡皂苷a和d的平均回收率分別為98.35%(RSD=1.26%)和97.64%(RSD=1.58%)。
2.9樣品測定取不同批號的藥材,按上述供試液的制備方法制備供試液。精密吸取對照品溶液5,20μl及供試品溶液10μl,分別注入液相色譜儀,按外標兩點法測定柴胡皂苷a,d含量,結果見表1。
3討論
3.1柴胡皂苷a,d為柴胡的主要有效成分,但在提取過程中其結構易發生變化,因此,嚴格控制提取條件十分重要。本實驗比較了甲醇、5%吡啶甲醇、5%氨水甲醇的提取效果。結果表明,5%氨水甲醇溶液超聲提取效果最佳。
表1樣品含量測定結果(略)
3.2采用5%氨水甲醇溶液超聲處理,分別測定了不同提取時間(20,30,40,50min)樣品中柴胡皂苷a,d的含量,結果在40~50min內樣品中柴胡皂苷a、d的含量基本不變。故文中采用超聲40min的方法。
3.3本文采用HPLCELSD法測定柴胡中柴胡皂苷a,d的含量,較采用紫外檢測器檢測,能明顯減少雜質峰的干擾,峰形好,出峰時間短,有利于提高檢測的準確度和工作效率。
參考文獻:
[1]國家藥典委員會.中國藥典,Ⅰ部[S].北京:化學工業出版社,2005:198.
[2]張本.柴胡屬植物藥理作用研究概況[J].吉林中醫藥,1983,3(1):39.
[3]王鵬,賈凌云,孫啟時,等.不同產地柴胡中柴胡皂苷的含量測定[J].沈陽藥科大學學報,2004,21(3):193.
[4]林東昊,茅仁剛,王智華,等.23種國產柴胡屬植物中柴胡皂苷a、c、d含量的RPHPLC測定[J].藥物分析雜志,2004,24(5):479.