醫學人類胚胎干細胞建立
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摘要：人類胚胎干細胞(HESCs)在人類發育生物學研究及再生醫學中具有重要的應用前景。人們在HESCs建系及其分化研究上已取得一些進展，但各個細胞系的生物學特性有一定差異，文章討論了有關HESCs的標準及相關問題。
作為人類早期胚胎學研究的窗口及其在再生醫學中的潛在應用，HESCs研究顯得非常重要。一些研究人和動物胚胎系統發生學的分子生物學家對HESCs功能性分析的分子學和細胞學標準作了一些評述，并指出未來一些重要的研究方法和途徑。本文討論了HESCs的研究進展，旨在就HESCs評價標準進行科學討論。
1HESCs的基本特點
胚胎干細胞(ESCs)有兩個比較顯著的特征：①可以自我更新并保持多能性和未分化狀態；②具有分化為多種特定細胞類型的能力。HESCs來源于人類早期胚泡(受精后5d)的胚胎內細胞團(ICM)。正如鼠胚胎干細胞(MESCs)一樣，HESCs具有以下幾個基本特點：①核型正常；②體外適宜培養條件下可無限擴增和存活；⑧冷凍和解凍后多數細胞可以復蘇；④體內外可以分化為多種細胞類型。HESCs的這些特點已得到了確認，但一些重要問題還有待解決。
2新的HESCs系的建立
許多國家暫停資助用于HESCs研究的國家基金，使HESCs建系研究受到限制，但由于已有經驗及其誘人的應用前景，眾多科學家及一些私人研究機構都在競相從事HESCs研究。相信會有更多新的HESCs系的建立。
3HESCs培養條件
目前，分離HESCs的方案均源自于MESCs的相關資料。即用免疫外科法分離得到人類胚泡ICM，無Ca2+-Mg2+培養液離散后培養在經處理以抑制其擴增的MEF或人類飼養層細胞上。資料報道適宜培養條件下HESCs可在體外未分化狀態下存活許多代(高達8O代)。
除了特定生長因子需求外，HESCs培養條件與小鼠相似。MESCs需要細胞因子如白血病抑制因子(LIF)，維持其多能性和未分化狀態，而HESCs多能性維持則不依賴于LIF，MEF條件培養基是否維持HESCs多能性的信號分子尚未確定。另外，在培養過程中，HESCs同其它人類細胞一樣需要成纖維細胞因子促其生長。培養過程中HESCs的長細胞周期影響其對不同培養條件的反應，且在許多方面與MESCs不同。
4HESC自我更新的調節
LIF對MESCs未分化狀態的有效維持是通過膜蛋白gpl30和stat3信號途徑的激活來實現的。雖然，HESCs不需要LIF保持未分化狀態，但(gpl30、JAK／STAT)下游信號途徑是否參與維持其未分化狀態尚未研究。HESCs和MESCs所共有信號途徑的程度將決定MESCs實驗方案適用于HESCs的程度。
5所有的HESCs系都相同嗎?
HESCs研究的一個相關問題是胚胎中存在多少種干細胞狀態?對這些問題的進一步研究需要比較不同HESCs系之間未分化狀態下多能性分子標記物以及細胞特點和多潛能性。這些研究在MESCs上已取得了很大進展，但HESCs上尚未開始。目前研究人員用一些MESCs的分子標記對HESCs系進行檢測。這些標記物在ESC中普遍表達豐富，我們建議將這些標記物分為兩類。I類標記物為明確定義的克隆化標記物，Ⅱ類為需要進一步多方面鑒定的標記物。并非所有的小鼠標記物均在人類細胞中表達。例如：SSEA一3和SSEA-4在HESCs表達，而在MESCs不表達；而MESCs表達SSEA一1，但HESCs不表達。確信，隨著對MESCs和HESCs深入研究和分析，會迅速得到許多ESCs標記物，這些特異性表達標記有助于規范HESC定義。
HESCs的分子標記。表1中所列13種分子標記都是鑒定未分化HESCs的。這些標記在未分化HESCs中表達(豐富)，分化后則消失。它們可分為兩類：I類，明確定義的克隆化標記物，II類，需多方面鑒定的抗體檢測細胞表面抗原。
6HESCs可進行怎樣的遺傳操作?
已有HESCs成功轉染操作基因并表達該基因的大量文獻報道。人類反轉錄病毒載體(例如痘病毒)以及生化策略表明了基因轉染HESCs的可能。如果HESCs用于醫療，克隆到病毒載體內的轉染基因的隨機整合應引起足夠重視。MESCs的位點特異性重組(剔除或剔入)功能缺失實驗，最近在HESCs上也有了類似報道，使HESC的遺傳操作成為可能。
7為何加強HESCs研究?
包括小鼠在內的各種動物構成其于細胞生物學的分子特征我們還不是很清楚，但是MESCs和HESCs間的差異已十分顯著。例如培養中的MESCs生長速度明顯快于HESCs；參與MESCs自我更新的配體已確認，MESCs通過遺傳操作的胚胎獲得；而且MESCs更適于作各種體內實驗而不受政治和倫理的影響。相反，HESCs很難得到且生長慢；其自我更新的分子機制還不清楚。HESCs也很難進行遺傳操作和體內試驗。顯然，討論有關HESCs和MESCs的基本問題同樣重要。
由于兩者存在差異，如果HESCs可應用于臨床，非模型系統HESCs研究將很有必要。
8HESCs是怎樣進行分化的?
體外，HESCs可分化為三個胚層的多種細胞類型(但不是全部)。培養的HESCs可分化為神經細胞、皮膚細胞、(表明外胚層分化)，血液，肌肉，軟骨，內皮細胞以及心肌細胞(表明中胚層分化)，還可分化成胰島細胞(表明內胚層分化)。另外，HESCs還可形成包括三個胚層的類胚體。雖然，HESCs的體外分化潛能與MESCs相當，但是目前還不清楚，這些分化是發生在正常的胚胎形成過程還是通過其它途徑來實現的?
發育決定具有時序性，在具體器官和特定細胞類型形成前，胚胎(包括HESCs)要產生三個胚層：外胚層、中胚層、內胚層。探尋器官形成的分子途徑，需要確定哪些活動為特定類型細胞形成所必需。例如：通過特定處理促進HESCs分化為特定內胚層如胰島細胞。因此，在細胞完成其最終命運前及時分化對于解釋細胞生長中的中間歷程很重要。理解正常的發育過程有助于我們設計ESCs促分化程序。雖然在動物模型胚胎中存在許多胚層標記物，但在人類胚胎中目前還沒有全面分析這些標記物。ESCs被定義為在體內能產生所有3個胚層和生殖系的一種細胞，將標記過的MESCs移植給不同階段(多為胚泡期)的小鼠胚胎，最終通過標記細胞評價ESC其生成生殖細胞的能力。HESCs體內分化潛能需要嚴密的檢測。由于倫理觀念，不可能將HESCs移植到人類胚胎，唯一公開報道的體內分化實驗僅是向免疫缺陷小鼠(如NOD／SCID小鼠)皮下注射HESCs，表明其分化特征類似于MESCs。注射后的小鼠形成有3個胚層的畸胎瘤，這有助于評價HESCs的多潛能性，但仍需要其它實驗評價HESCs具有產生胚外細胞及生殖細胞系的潛能。
9HESCs分化能力分析
HESCs體內外分析體系的改進對了解與HESCs分化有關的生物學知識非常必要，也是其在再生醫學中應用的前提。根據在魚類、青蛙、雞和小鼠胚胎組織發育研究的結果已建立了一些離體分析體系。
建立體內分析體系比離體分析體系要困難。依據動物模型建立的經驗，設計了兩種簡單的體內試驗，首先，將標記過的HESCs移植入非人類成體或胎兒特定組織的一定部位以檢測其與宿主組織整合的能力。類似實驗將小鼠于細胞體外分化的運動神經細胞移植至雞胚，結果表明這些小鼠干細胞源神經細胞參與脊髓形成。已有相關報道表明，人類胎兒和成體神經干細胞以及造血干細胞可移植至小鼠胎兒并能參與多種器官形成。第一個實驗檢測特定胎兒環境的局部作用，第二個實驗則將標記過的HESCs移植入非人類早期胚胎中檢測HESCs與宿主組織的整合能力。包括小鼠和雞胎胚模型系統的HESCs移植有助于評價HESCs參與宿主組織和器官的形成。此類實驗應該是短暫的，即在妊娠的不同時期，胚胎可能被排斥；我們意識到第二個實驗需要適當的科學制度的支持。
10HESCs研究的基礎設施建設
由于生物材料來源限制，HESCs研究的基礎設施建設尤為重要。作者建議建立HESCs貯藏庫并注冊，類似于英國提議的干細胞庫，這個貯藏庫收集所有HESCs系(包括2001年8月9日后所有建系)，用上述標準對其標準化并保證學術機構研究應用，質量監控和規則可參照一些已建立的中心體系如美國標本培養收藏協會。貯藏庫要負責HESCs的收集和供給，這將有助于解決研究者的困境。HESCs貯藏庫應包括一個大學機構和研究人員都可獲得的網絡數據庫，此數據庫收集所有有關HESCs和人類胚胎的數據。注冊點向許多地區提供和獲得相關資料，包括微陣列分析結果(原始數據)或一些細胞傳代法，HESCs系的生長和培養條件，分化潛能以及鑒定方法。
這需要特別重視兩個方面，首先已有資料(如原始微陣列數據)的質量監控必須為一個委員會嚴格限定和擁有。作者建議這個委員會由一些具有分子胚胎學、高質量數據分析以及生物信息學專業知識的科學家組成。
其次，資料信息的保存和累積需要長期的義務性努力。本文所述僅是一個起點，期望隨著有關HESCs和人類胚胎學知識的不斷豐富，HESCs標準會更加具體和豐富。
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