差異基因技術應用
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【關鍵詞】,差異表達基因；差異顯示PCR方法；消減雜交法
［摘要］差異表達基因與疾病密切相關，深入研究可在基因水平揭示疾病的發病機制，從而探索疾病治療的有效方法。隨著分子生物學技術的發展，各種研究差異表達基因的方法應運而生，盡管每種方法都有其缺陷和不足之處，但畢竟為我們提供了切實可行的研究方法，現就目前的主要研究技術做一綜述。
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［關鍵詞］差異表達基因；差異顯示PCR方法；消減雜交法
Technologyondifferentialgeneanditsapplication
［Abstract］Differentialexpressiongeneisrelatedtothediseases.Tostudythesegenesdeeplymaycontributetoexposethepathogenesisofdiseasesingenelevelandexploretheeffectivemethodstocurethediseases.Withthedevelopmentofmolecularbiology,allkindsoftechnologyappearedtostudydifferentialexpressiongene.Althoughitslimitation,thesemethodsprovidethefeasibletechnologytostudydifferentialexpressiongene.Thearticlereviewedthemajortechnologyofdifferentialexpressiongene.
［Keywords］Differentialexpressiongene;differentialdisplayPCR;subtractivehybridization
在高等生物個體發育中，不同組織細胞在不同時期的基因表達按照時間和空間順序有序地進行，稱之為基因的差異表達；那些異常表達的基因可能直接或間接關系到疾病的發生和易感性。篩選和鑒定這些差異表達的基因對于從基因水平揭示疾病的發生機制，探索疾病治療的有效方法具有重要意義。現就目前研究差異表達基因的主要方法及其原理分述如下。
1cDNA微陣列技術（cDNAmicroarrayhybridization）
該技術是指在固相支持物上直接將大量已知序列的探針有序固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交，雜交信號陽性的探針序列就是在組織或細胞中表達的DNA序列。cDNA微陣列技術具有商品化的芯片，DNA樣品形成致密的微集陣列，其集成度可達2萬個點陣/cm2［1］。該技術可用于大規模篩選差異表達基因。Midorikawa等［2］為了闡明雄激素脫發患者脫發區和未受累部位毛乳頭細胞基因表達譜的差異，通過該技術篩選到107個差異表達基因；其中BMP2和ephrinA3的基因表達顯著下調，因此認為BMP2和ephrinA3在毛發周期中具有促進毛發生長的作用。該技術用于疾病診斷和藥物療效評價，用于診斷是否攜帶艾滋病病毒［3］的基因芯片已經問世；有學者［4］應用該技術評估咪喹莫特治療HPV2/27/57引起的生殖器疣，明確了咪喹莫特對生殖器疣的治療作用。盡管該技術具有良好的應用前景，但目前序列確認的人類cDNA克隆還相當缺乏，在一定程度上局限了DNA芯片技術的發展；基因芯片造價很高，目前只有大制藥公司和研究所能承受，這些都限制了其應用范圍。
2基因表達系統分析（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）
SAGE其原理是以mRNA為模板，用生物素標記的Oligo（dT）為引物合成雙鏈cDNA，以限制酶進行酶切，捕獲cDNA3′端；產物被分為兩部分，分別與包含有標簽內切酶位點的A、B連接子相接。經過酶切，就有可能得到只有9~10bp的標簽序列。每兩個標簽的鈍端結合后成為PCR的模板，以基于A、B連接子的引物進行PCR反應的結果是得到了大量每條包含兩個不同來源標簽的序列，接下來再用限制酶酶切、連接，就能將多個不同的標簽鏈接在一起，克隆至質粒載體中后集中測序。SAGE可以檢測不同細胞間已知基因表達的具體差異，系統地分析基因表達的差異。Cornelissen等［5］運用該技術，從艾滋病相關Kaposi’s肉瘤的基因表達譜獲得64個表達顯著上調的基因，28個表達下調的基因。Urschitz等［6］應用該技術研究了曬傷皮膚的基因差異，明確表皮在曬傷皮膚的發病中發揮主要作用。SAGE技術的缺點在于工作量大，有大量的測序及計算機分析任務；對于尋找新基因而言，僅用長度為13bp的寡核苷酸探針篩選cDNA文庫導致假陽性結果居多。
3差異顯示PCR方法（differentialdisplayPCR,DD-PCR）
利用可以擴增所有哺乳類mRNA的幾條5′特定引物和幾條3′錨定引物隨機組合，將cDNA進行PCR擴增，這樣對于相同的cDNA，PCR產物的種類多少和分布應該是完全一樣的，而對于不同的cDNA則可以找到差異條帶，它們所代表的cDNA就有可能與細胞狀態的改變或疾病狀態相關。
差異顯示PCR方法具有快速、所需RNA量少、可同時顯示多種生物性狀的差異及可以同時獲得高表達和低表達的基因等諸多優點；但假陽性率高，可高達70%的假陽性條帶［7］；不能反映低拷貝mRNA的差異，對高拷貝基因有偏向性；獲得的片段多為300bp左右的3′非編碼區，很難判斷其功能和意義，只能提供研究線索。
哺乳動物的創傷愈合常需要數周至數月時間，伴有瘢痕形成且機制不明，MRL/MPJ（MRL）鼠具有無瘢痕愈合的能力，Masinde等［8］采用差異顯示PCR方法研究了參與MRL/MPJ（MRL）鼠無瘢痕創傷愈合的基因，鑒定了36個與創傷愈合有關的差異表達基因，為無瘢痕創傷愈合的研究提供了靶基因。
4消減雜交法（SH）
經典的消減雜交法是將實驗組mRNA（或cDNA）與對照組cDNA（或mRNA）雜交，去除雜交體和未雜交上的對照組成分（cDNA或mRNA），得到實驗組獨有的cDNA或mRNA，這些基因即為差異表達基因。為克服傳統的消減雜交法的不足，新的消減雜交技術應運而生。
4.1代表性差異分析技術（RDA）原理是首先用DpnⅡ或Sau3AI酶切兩組雙鏈cDNA，兩端接上單鏈接頭R，補平后，用含接頭R序列的引物擴增，再用DpnII或Sau3AI去除雙鏈cDNA兩端的接頭R；只給予實驗組雙鏈cDNA兩端再接上單鏈接頭J。將實驗組與驅動組cDNA雜交，雜交反應體系中只有實驗組自身雜交形成的雙鏈cDNA才兩端都帶接頭J，補平后可被含有接頭J序列的引物幾何級擴增，而只有一端帶接頭J的雜交體只能被線性擴增。將此雜交產物再進行第二輪酶切、加接頭、雜交和PCR擴增，重復兩次后，可確保從實驗組中徹底去除與驅動組共有的序列。
其優勢為：（1）高效性，與傳統的消減富集相比，更加敏感，可以篩選出低拷貝的差異基因；（2）可靠性，結果重復性好，假陽性率非常低。Chang等［9］結合cDNA-RDA和膜雜交篩選，對比正常人口腔黏膜上皮和HPV永生化的口腔上皮細胞系，獲得了384個差異表達的克隆，并證實其中含69種差異基因。[]
cDNA-RDA技術的局限性在于：（1）得到的差異片段是平均為300~600bp的小片段。（2）由于cDNA較基因組DNA短，消化后可造成cDNA序列兩端信息量丟失。（3）完全無酶切位點的片段無法參與RDA篩選。（4）在極低拷貝差異基因的篩選上進行了改進，但仍有不足［7］。
4.2抑制消減雜交法（SSH）SSH是抑制PCR與消減雜交技術相結合的更簡單快速的分離差異基因的方法。其原理是豐度高的單鏈DNA在退火時產生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈DNA，從而使原來在豐度上有差別的單鏈DNA相對含量達到基本一致；而抑制PCR則是利用鏈內退火優于鏈間退火的特點，使非目的序列片段兩端反向重復序列在退火時產生類似發卡的互補結構，無法作為模板與引物配對從而選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增。這樣既利用了消減雜交技術的消減富集，又利用了抑制PCR技術進行了高效率的動力學富集［10,11］。
SSH技術形成了自身的優勢：（1）提高了特異性，降低了假陽性率。（2）具高度靈敏性，克服了低豐度mRNA不易檢測的問題，這個方法簡單到只需一輪雜交即可分離出差異基因。（3）提高了基因克隆的效率，提高了信息量，更具代表性。（4）可同時分離上百個差異表達基因。（5）程序相對簡單，操作簡便，接頭設計簡化且不需反復交換接頭。
許多學者應用該技術成功獲得針對不同疾病的靶基因，Yin等［12］發現T細胞在感染HIV-1ⅢB后經歷了細胞的凋亡和功能恢復，于是應用SSH技術構建了HIV-1ⅢB感染第7天和第18天的差異基因表達譜，建立了2個消減cDNA文庫，在兩個時間點篩選到200個高度表達的差異基因，鑒定了特異性凋亡相關基因和其他候選興趣基因；Northernblot分析確定了在兩個時相的優勢表達基因，為HIV-1感染的治療提示了新的方式。
盡管SSH技術具備諸多優勢，但其所需mRNA量達2μg，樣品來源較易且新鮮，非酶切位點的突變、缺失或插入均不能有效被發現；得到的為cDN段尚需擴增其全長；完全無酶切位點的片段或酶切位點較少的基因組無法用SSH技術篩選。
4.3基于PCR的消減雜交法（PCR-basedsubtractivehybridization）該方法是分別將實驗組和對照組的mRNA進行反轉錄；對于實驗組，利用mRNA的3′polyA尾和5′-GGG帽結構分別在cDNA兩端加上序列相同的錨定引物；對于對照組，將其cDNA進行隨機引物PCR擴增制備探針，同時摻入生物素（Biotin-11-dUTP）。然后將實驗組的cDNA與摻有生物素的探針進行雜交，雜交反應物用連有鏈親和素的磁珠吸附掉雜交體及未雜交上的探針，得到實驗組獨有的cDNA，然后用錨定引物將其擴增并克隆。
該技術具有兩大優勢：一是雜交后未雜交上的實驗組單鏈cDNA可直接作為模板被擴增，所以低豐度的cDNA被擴增的幾率大大提高；二是可以直接獲得全長cDNA，使獲得功能基因的速度大大加快。Li等［13］利用該技術篩選了抗原活化的樹突狀細胞（DC）的差異表達基因，并成功獲得了新的全長cDNA：KE04。
Meije等［14］應用該技術從黑素細胞、痣細胞和非轉移黑素瘤細胞的差異表達cDNAs文庫中，篩選了Ras相關蛋白Rab5b、pCMa1和pCMn2基因等12個新基因；pCMa1的表達量在轉移性惡黑高于原發性惡黑；pCMn2在轉移和非轉移惡黑均有表達，但在正常黑素細胞和痣細胞不能檢測到。Rab5b顯示在高度轉移惡黑的表達顯著低于其他類型的惡黑，這3個cDNAs可能參與了黑素細胞的早期形成和惡性轉化。
盡管這些具有代表性的方法雖然都不是很完善，不能預期通過它們得到所有的差異表達基因，但通過這些技術已經獲得了大量的重要基因；隨著各種差異表達基因篩選技術的不斷完善，許多常規不能篩選到的低豐度差異表達基因、全長cDNA可望得以分離和鑒定。
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