醫學青光眼基因治療

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【摘要】最近研究表明，青光眼患者眼壓升高及視網膜節細胞損傷和死亡可能與某些相關基因的結構及功能異常有關，因此，基因治療作為一種新的治療方法已逐漸在醫學領域中應用,為青光眼的防治提供了廣闊的前景。本文對目前進行的基因治療研究進行綜述。

【關鍵詞】青光眼基因治療

Advancesingenetherapyforglaucoma

AbstractPreviousstudiesinmoleculargeneticshaveindicatedinglaucomaelevatedintraocularpressureanddamageofdeathofretinalganglioncellsmayberelatedtotheabnormalityofrelatedgene.Sogenetherapyhasbeengraduallyappliedinmedicaldomainasakindofnewtreatmentmethod,itprovidesextensiveprospectforthepreventionandcureofglaucoma.Thispaperreviewsadvancesingenetherapyforglaucoma.

·KEYwordS:glaucoma;genetherapy

0引言

青光眼是一組以進行性視神經損害和神經元喪失為特征的眼部疾患。青光眼作為全世界第二位的致盲眼病,其有效防治越來越成為防盲治盲和公共衛生工作的重點。眼壓升高和缺血是引起青光眼性視網膜神經節細胞(retinalganglioncells，RGCs)喪失的兩個刺激因素，高眼壓將直接損害視神經軸突，并導致RGC不可逆性喪失。由于RGC死亡的確切分子機制還不是很清楚，目前還沒有有效的治療來預防嚴重青光眼患者的視功能喪失[1]。目前青光眼的治療仍以降低眼壓為主,但常用的藥物存在較嚴重的并發癥。而手術治療如濾過性手術,效果不是很理想，一方面很多患者術后因發生濾過泡疤痕化而影響眼壓控制，另一方面一些患者即使眼壓已經控制達正常范圍,他們的視功能損害仍繼續進展,且無有效的治療方法。

基因治療是用基因工程技術,對基因進行改建、修飾和置換,或對異常基因表達進行干預以治療疾病的方法。其含義是從導入基因糾正遺傳病的基因缺陷,擴大到導入外源基因達到治療效果的所有治療方法。轉基因技術適合治療青光眼，在于青光眼的慢性過程和比較明確的病理學基礎[2]。解剖學、遺傳學和基因表達圖譜已經證明轉基因技術治療青光眼，包括改善房水引流、減少濾過泡疤痕形成和保護RGC已成為可能。本文對青光眼基因治療研究現狀進行綜述。

1轉基因治療青光眼的靶組織

青光眼基因療法特有的靶組織結構或細胞類型包括小梁網(trabecularmeshwork,TM)、睫狀上皮(ciliaryepithelium,CE)、睫狀肌(ciliarymuscle,CM)、視網膜神經節細胞(retinalganglioncells,RGCs)和Müller細胞(MCs)。小梁網位于前房角，是一種由不同內皮細胞和細胞基質以特定結構形成的海綿狀組織;它負責維持房水流出的阻力和保持眼球的形狀。睫狀上皮包括兩種緊密連接的覆蓋在睫狀突的細胞層，外層細胞面向后房，是非色素性上皮，主要分泌房水。房水產生后，進入前房，通過小梁細胞和內層Schlemm管壁離開眼球而進入靜脈系統。睫狀肌緊鄰睫狀上皮和小梁網。一旦睫狀肌收縮，晶狀體調節力增加，小梁網的構型發生變化，房水流出易度增加。RGCs，視網膜的最內層細胞，通過其軸突將光信號傳導至大腦，其軸突組成了視神經。許多刺激傷害，通常是眼壓升高引起RGCs損害和凋亡，最后導致視神經纖維喪失[3]。

2青光眼基因治療的有關載體

能將遺傳物質傳送入視網膜或RGC的載體系統至少應具備以下四種生物學特性：(1)能對準目標的特有細胞類型，其目標或者是受染細胞，或者是鄰近細胞，例如，引入分泌性治療藥物的基因。(2)基因傳導應該有效，即現有的載體滴度和有限的劑量可以很安全地注射入各種視網膜間隙，傳代基因能有效地復制，并進入足夠多的靶細胞，允許治療藥物在視網膜特定部位進行表達。(3)載體相關表達應該恒定并適當地持續較長時間。(4)載體本身毒性應該很低，這包括藥理學毒性、針對傳導基因產物、輸入載體或者源于輸入載體的任何表達基因的局部和全身免疫反應。

目前用于青光眼轉基因治療，并滿足這些生物學特性的載體可分為病毒和非病毒兩種方法：

2.1病毒方法病毒方法是利用載有目的基因的復制缺陷病毒感染靶細胞。

2.1.1相關的DNA病毒載體⑴腺病毒(adenovirus，Ad)載體：最初的腺病毒載體能夠搭載大約8kb的傳代DNA。幾種早期的病毒基因的附加失活作用產生的復制缺陷病毒載體能夠在傳導的視網膜細胞中生長并形成很高的滴度。基因表達通常在接種后24h內出現，這使得在動物模型中進行研究變得非常方便。重組的腺病毒由于宿主對輸入的病毒顆粒本身和因為感染而產生的大量病毒蛋白質的反應，故具有相對的免疫原性。然而，眼部的相對免疫特性使得暫時性的腺病毒相關的基因治療仍然有效。由于重組的腺病毒DNA并不能穩定地整合入宿主染色體的DNA中，所以其在眼組織中傳達的基因表達是暫時性的，一般保存1～3mo。如果其引起的免疫反應能進一步減輕的話，特殊的短期基因治療干預，將是有利時機[4]。⑵腺相關病毒(adeno-associatedvirus，AAV)載體：通常這種病毒感染人類，并不引起已知的疾病。它是一種小的單鏈DNA病毒，它本身只產生非常小的蛋白質，因此具有相對的非免疫原性。如果沒有與野生型輔助病毒(通常是人類腺病毒)一同感染，野生型AAV能穩定地整合入人類19號染色體的特定位點，并建立隱匿性感染。相反，由于在重組的AAV(rAAV)中刪除了這種特殊整合位點所必需的病毒rep蛋白質，目前的AAV載體并不具備這種特性。然而，體內實驗顯示，rAAV能在長達數周或數月內緩慢地整合入隨機的染色體位點，這取決于靶細胞，也使得長期性的、或者是永久性的傳導成為可能。與重組的腺病毒不一樣，rAAV似乎能傳導正常的RGC和光感受器細胞與視網膜色素上皮細胞。但是，當前的rAAV具有兩大缺陷：①它限定了搭載的DNA不能超過4.8kb。盡管AAV適合于目前的可用于視神經保護治療的絕大部分基因，但是，只有有限的空間用于調節成分，這是為精確地協調和控制基因表達所必需的，才能起作用。②如果rAAV整合確實是隨機的話，理論上就存在插入的基因突變。這使得臨床前期研究比其他載體更加費時，而且不可能很快用于視網膜變性疾病的動物模型中。目前一種新的，更加有效的rAAV包裝技術能很好地避免低病毒滴度和野生型腺病毒輔助劑的低水平污染引起的一些早期問題[5]。⑶單皰病毒(herpessimplevirus,HSV)載體：HSV能有效地將有益基因轉入青光眼相關的結構和細胞。在猴和嚙齒類，通過前房注射，在TM和CE轉染效率很高，而其他細胞如虹膜色素上皮細胞和角膜內皮細胞轉染效率較低。只有在CMV啟動子和HSV載體一起進行實驗時，基因表達最多持續10d[6,7]。HSV在RGCs亦能產生有效的轉染，但在靈長類，其傳導位置只局限于傳送部位[3]。

2.1.2逆轉錄病毒(RV)載體其優點是目的基因可以整合到染色體上,可以實現穩定長期表達,而且轉移效率高。但目前應用于基因療法的大部分RNA病毒載體都是源于鼠類白血病逆轉錄病毒。它不能轉染非增殖期的細胞,所以不適用于角膜內皮及視網膜等組織的基因轉染。相反，基于人類免疫缺陷病毒(humanimmuno-deficiencyviruses，HIV)和猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyviruses，SIV)的慢病毒載體(lentiviralvectors)，編碼諸如vpr之類的蛋白質，允許細胞核輸入病毒基因組，而不影響相伴隨的有絲分裂。慢病毒載體(lentiviralvectors)：這種載體通常是假表型的，即為包被另外一種病毒蛋白質作準備。能夠以這種方式搭載慢病毒，并具有這種特性的細胞通常是CD4+T細胞，允許慢病毒感染多種細胞。慢病毒含有泡狀口腔炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV-G)的糖蛋白，已經成功地用于鼠類視網膜。在一次接種后能感染整個視網膜，并能至少穩定3mo。它需要將染色體整合，才能獲得基因表達，這提示病毒載體能在RGC進行長時期傳導。但是這種載體具有以下幾種技術缺陷：①任何基于人類的免疫缺陷病毒的載體系統在可以用于人類之前，都必須證明不會產生野生型人類免疫缺陷病毒。許多新近的基于病毒載體已經刪除了原來的人類免疫缺陷病毒基因組的重要節段，因此，進一步減少了產生感染性病毒的危險性。②按照目前的滴度，需要30～100μL重組病毒才能達到整個人類視網膜。最近，病毒顆粒的穩定性和濃縮技術已得到明顯改善，因此，容量問題將會被解決。③需要關心的是基于人類免疫缺陷病毒載體的整合問題。整合位點似乎是隨機的，因此，可能存在整合所導致的基因突變。很可能需要更精細和更大的啟動子以平衡轉基因和內源性基因的長期表達。染色質結構已被認為是基因表達的重要調節子，并強化了近端啟動子不僅僅只是一個重要想法的思想。病毒載體整合入基因組的位點往往影響治療性基因的表達，所以，下一代的啟動子應該含有開放性染色質的調節子，諸如位點控制元素，它可以在一些情況下以暫時性的方式上調或下調治療性基因產物水平。繼續研究視網膜細胞特殊的啟動子，已被認為是基因療法的必要進展[8]。Lotery等[9]通過玻璃體切割和視網膜下注射將重組的貓免疫缺陷病毒(recombinantfelineimmuno-deficiencyvirus,rFIV)載體將β半乳糖酶基因轉染入cynomolgus猴視網膜。結果表明光感受器和Müller細胞有極好的轉基因表達。局部炎癥反應只局限在注射部位。電生理檢查表明，視功能不因載體注射而受到明顯影響。這提示視網膜下應用rFIV載體能轉導非靈長類視網膜各種類型的視網膜細胞，rFIV載體具有潛在的治療作用，并可用于人眼的基

因療法。Loewen等[10]采用視網膜下注射2μL的貓免疫缺陷病毒(felineimmuno-deficiencyvirus,FIV)或腺病毒載體，比較兩種載體行視網膜轉基因的長期表達情況，在劑量-反應研究中，2×105傳導單位(transducingunits,TU)中，兩種載體在視網膜的傳導范圍一致;但在長期表達研究中，在不同的時間點(1wk;1，3，6，12和16mo)FIV載體的表達程度(grade)均比腺病毒載體高。但大部分腺病毒注射眼均出現了局部巨噬細胞樣細胞的聚集和視網膜結構的破壞。結果表明，慢病毒載體經隨訪16mo仍能持久表達，可用于慢性視網膜疾病的基因治療。

2.2非病毒方法包括脂質體介導法和受體介導法等。與病毒方法相比,沒有致癌性,也排除了病毒感染,缺點是整合率低。近年來,人們對脂質體介導的轉移方法有了較多的研究,轉導效率有很大提高,如脂質體轉染試劑Lipofectin及其新一代產品Lipofectimine。Hangai等[11，12]用其特殊的脂質體轉染系統對視網膜感光細胞層取得了較好的轉染效果,但基因表達時間較用AV載體明顯短,注射后30d時基因表達已經十分微弱或消失。由于脂質體介導法還具有安全、方便的優點,所以是一種很有前途的目的基因運載體系。Hart等[13]用受體介導法轉染視網膜組織也取得了較好效果。

3青光眼的基因治療效果

盡管大多數青光眼的遺傳基因尚不清楚，但編碼眼壓降低和/或視神經保護基因的轉染和表達可改變相關細胞的生理狀態和阻止發病。與其他慢性疾病一樣，應用基因治療青光眼將提供長期有效的治療效果。

3.1改善房水循環目前可用于處理眼前節組織降低眼壓的藥物必須每天用藥，那么順從性是個主要問題。基因療法可以減輕這個問題。

3.1.1減少房水的生成房水的生成主要靠睫狀突非色素上皮逆濃度梯度,將Na+泵入后房。睫狀突非色素上皮細胞緊密連接,形成血-房水屏障,在Na+/K+ATP酶的作用下,Na+由細胞主動分泌入后房,這是一個耗能過程,且與HCO3-和Cl-協同轉運。而通過α2，β2腎上腺素能受體可調節腺苷酸環化酶的活性,繼而影響Na+/K+ATP酶的活性[14]。目前許多藥物都有抑制與房水生成相關的酶或離子泵的作用,如Na+/K+ATP酶對烏巴因(ouabain)敏感,可被其抑制而減少房水的生成;目前應用較多的β2受體阻滯劑,其作用機制就是抑制睫狀體上皮的離子泵或酶的活性,引起第二信使的改變從而抑制房水的生成。以上研究結果提示,可以通過影響與房水生成相關的幾個步驟減少房水的生成。根據房水的生成原理,目前至少可由以下幾個途徑通過基因敲除的方法減少房水的生成：⑴基因敲除與房水生成相關的酶或相關的離子通道;⑵基因敲除腺苷酸環化酶減少房水的生成;⑶基因敲除G蛋白,減少房水的生成。

3.1.2疏通房水流出通道增加房水的排出將外源基因導入小梁網以治療青光眼，Borras等[15]將外源基因導入小梁網細胞中,基因可表達7d。Budenz等[16]將含有lacZ基因的腺病毒載體注入前房和玻璃體內,結果發現小梁網細胞可表達持續14d。使用灌注眼培養系統,Borras等[17]將管蛋白(tubulin)基因導入小梁網細胞中,可降低眼壓。

3.2視神經及視網膜神經節細胞的保護性治療[18]青光眼性RGCS凋亡的激發因素主要有神經營養因子的剝奪和興奮性毒素一氧化氮的毒性作用。高眼壓或低血流灌注壓導致缺血缺氧等，使RGC軸漿流中斷，靶源性神經營養因子供應中斷，同時興奮性毒素大量產生，激活誘導凋亡的基因作用于細胞表面受體，啟動RGC凋亡程序。已有研究表明重復眼內注射神經營養因子能暫時性拯救因軸突損傷導致的RGC死亡。采用基因療法轉染這些營養因子，能克服重復注射帶來的并發癥。

腦源性神經營養因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)是一種重要的RGC存活因子。DiPolo等[19]通過玻璃體腔內BDNF表達的腺病毒載體能暫時性延緩視神經橫斷性損傷后RGC死亡。但是基于腺病毒載體的轉基因表達有效時間相對較短，而且其本身易引起炎癥反應。腺相關病毒(AAV)載體能夠在視網膜進行長期的轉基因表達，引起的眼部炎癥反應很輕微。Martin等[20]通過采用532nm二極管激光處理大鼠小梁網引起中等程度的慢性眼壓升高，只導致特異性的RGC喪失，而不損害其他視網膜層。他們采用獨創的AAV-BDNF結合土撥鼠肝炎逆轉錄調節元素(woodchuckhepatitispost-transcriptionalregulatoryelement,WPRE),單次玻璃體腔內病毒注射2wk內就很容易在大鼠RGC層神經元產生很高的轉染效率。結果表明實驗性青光眼4wk后，玻璃體腔內注射AAV-BDNF-WPRE與單純注射生理鹽水或不含BDNF的對照病毒相比，能明顯增加RGC的存活率(軸突計數)，進一步支持神經營養療法可作為青光眼降低眼壓的補充治療的潛在可行性。

Dingwell[21]等證實堿性成纖維生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)在RGC生長發育過程中是一種潛在的刺激因子。但Cui[22]在視神經顱內段軸性損傷后，采用眼內注射bFGF蛋白質未能顯示RGC再生。據推測，這是由于bFGF在體內的半衰期很短，在眼內持續時間有限。Sapieha等[23]采用視神經微壓榨傷(micro-crushlesion)制作視神經損傷模型，用重組AAV將bFGF基因轉入成年SD大鼠玻璃體腔，以利于bFGF的持久釋放。與對照組的神經相比，FGF-2基因轉染后，視神經軸突從病變部位向后的數量要多10倍，這種上調反應與FGF受體-1表達相關。bFGF轉基因表達只對受損的RGC起暫時性的保護作用，而且這種神經營養因子對軸突延伸并不能代表神經元存活數量的增加。

近年來，睫狀神經營養因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNDF)被證明是能改善受損的RGC的存活與再生最有前途的神經營養因子之一。VanAdel等[24]采用視神經橫斷性損傷作為在體模型，評價具有自我失活的復制缺陷的慢病毒相關的載體轉染人類睫狀神經營養因子(SIN-PGK-CNFT)對成年大鼠RGC軸突存活率的影響。他們采用單次玻璃體內注射慢病毒編碼的人CNTF(LV-CNTF)基因或細菌β-半乳糖酶(LV-LacZ)作為對照組，在大鼠視神經軸性損傷后14d與21d檢測RGC的存活情況。結果表明，與對照組相比，用lentiviral作為載體應用CNTF，能明顯增強RGC的存活，而且效果比單純玻璃體內注射重組人CNTF要好。

色素上皮源性因子(pigmentepithelium-derivedfactor,PEDF)，是一種50kDa蛋白質，由人胚胎視網膜色素上皮細胞分泌。已經證明PEDF是一種有希望的內源性新生血管形成抑制劑和神經保護蛋白質。Takita等[25]采用前房內灌注生理鹽水，將大鼠眼壓升高至110mmHg，持續60min，制作壓力誘導的視網膜缺血-再灌注模型。在模型制作前4d玻璃體腔內注射腺病毒載體表達的PEDF(AdPEDF.11)顆粒。結果表明，節細胞層細胞密度明顯多于對照組(AdNull.11);但凋亡細胞數(TUNEL陽性細胞)明顯少于對照組。提示腺病毒載體相關的眼內PEDF表達能明顯增加視網膜缺血-再灌注(急性高眼壓)損傷神經元的存活率，這種保護作用可能源于抑制缺血誘導的凋亡，并認為轉基因方法能直接干擾因視網膜缺血所導致的細胞程序化死亡。

原癌基因bcl-2的過度表達可以減少細胞凋亡，但它是否影響軸突再生尚無定論。bcl-2在胚胎感覺神經元的體外實驗以及生后受損RGC的體內、外實驗中可以促進軸突生長，但卻不能誘導新生小鼠軸突重建。在成年嚙齒類動物，即使去除了髓鞘相關抑制分子或加入周圍神經移植物，bcl-2過度表達仍不能進一步加強軸突再生。Bcl-XL是bcl-2家族的一個成員，去除該基因可增加發育性細胞死亡，而過度表達可保護生后及成年神經元免于創傷、缺氧、代謝等損傷[26]。Kretz等[26]將Bcl-XL通過腺病毒載體在體外、體內受損的RGC中過度表達后，發現能使培養的RGC軸突的數目、總長度增加，活體視網膜內RGC的軸突可以長入鄰近的視神經斷端，但不能通過瘢痕形成的區域。其中機制有待闡明，Bcl-2和Bcl-XL很可能是通過調節細胞存活和再生的通路而起作用的。

3.3抑制濾過泡的瘢痕化[27,28]眼壓升高是青光眼的主要危險因素，施行手術降低眼壓仍然是治療青光眼的主要手段。濾過性手術是目前常用的抗青光眼手術，但術后濾過道的疤痕形成將導致手術失敗，因此常常在術中或術后聯合應用抗代謝藥物，如絲裂霉素C(mitomycin,MMC)和5-氟尿嘧啶以減少濾過道的疤痕形成。但它們同時也會產生意想不到的副作用，如低眼壓和由于細胞破壞導致的組織變性。基因療法能預防青光眼濾過性手術后增殖的傷口愈合反應。Perkins等[29]給新西蘭白兔施行

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全層鞏膜切除術，并在以角膜緣為基底的結膜瓣下放置浸有含人p21基因(rAd.p21)的復制缺陷的重組腺病毒、非特異的綠熒光蛋白標記基因(greenfluorescentprotein，GFP)、β-半乳糖酶(beta-galactosidase)、MMC(0.5g/L)及平衡鹽溶液的纖維素海綿5min。結果表明，經rAD.p21基因處理的筋膜成纖維細胞DNA合成和細胞生長呈現劑量依賴性抑制。但MMC引起薄壁濾過泡、前房積膿等并發癥，在rAD.p21基因處理組未發現。兩組在實驗結束時均可見功能性濾過泡。這提示rAD.p21基因療法能為青光眼濾過性手術提供有效的抗纖維增殖作用，但沒有MMC相關的并發癥發生。為進一步了解rAD.p21基因的適應證，Wen等[30]研究了兔眼結膜局部轉染腺病毒p21基因后，載體傳送、靶組織的轉基因表達、炎癥反應、非靶組織的生物分布和免疫反應等特征。結果表明，結膜下注射rAd.p21后，其生物分布只局限于眼組織;濾過性手術后，將rAd.p21轉染至結膜下，術后早期引起急性炎癥反應，但到第14天時與安慰劑對照組無明顯區別。這些結果顯示，將基因局部轉染至結膜是一個非常合適的眼部基因轉染模型。

Heatley等[31]先采用重組腺病毒將人類p21(WAF-1/cip-1)基因引入猴高眼壓眼，然后施行小梁切除術，結果表明經p21處理眼造瘺口在功能上、組織學上均保持開放，并沒有發現在對照眼上出現絲裂霉素C治療的副作用。Yoon等[32]在正常兔眼施行青光眼濾過性手術后，結膜下注射2μghumanRAD50(hRAD50)基因，采用光鏡和電鏡比較hRAD50處理組與MMC處理組和正常對照組的形態學改變。結果表明，局部應用RAD50的抗纖維增殖作用與MMC相同，但沒有結膜上皮基質層的損害，提示hRAD50可作為一種可能的抗纖維增殖藥物用于青光眼濾過性手術，但需要更進一步研究其可能存在的全身并發癥。

4與青光眼組織相關的潛在的靶基因

4.1小梁網①細胞骨架調節蛋白：通過破壞細胞骨架結構，刺激房水流出增加;②Myocilin基因：高度表達野生型位點，競爭突變位點;③金屬蛋白酶：細胞外基質重新塑型[3]。

4.2睫狀上皮①調節房水生成24h節律的基因：減少夜間房水生成增加所導致的潛在性的危險眼壓水平。②β腎上能受體增進睫狀體細胞對藥物反應的潛能，抑制房水生成。③減少房水生成的其他基因(神經多肽鏈)：調整小梁網和睫狀肌的功能[3]。

4.3睫狀肌細胞①X基因：上調前列腺素的合成;②金屬蛋白酶：產生基質金屬蛋白酶，增加葡萄膜鞏膜通道房水流出[3]。

4.4視網膜神經節細胞①神經營養素受體(TrkB)：增加RGC對神經營養因子反應的潛能;②神經營養素基因(BcIX)：增加內源性抗凋亡基因產物水平以拮抗BAX功能;③Bax基因：反義結構以減少BAX蛋白水平;④Hsp70/72基因：增進RGC對內源性刺激反應能力，以抵抗損害性刺激[3]。

4.5Müller細胞①GLAST：上調內源性谷氨酸鹽運輸體，增進細胞外基質谷氨酸鹽水平;②神經營養素基因：為RGC提供神經營養素的替代資源[3]。

5青光眼基因治療存在的問題和展望

基因治療最常見的負面反應表現在前房內出現的主要由單核細胞浸潤組成的炎癥反應。這種反應在靈長類比嚙齒類更常見，至少發生在HSV載體中。在注射高濃度腺病毒載體時，兔眼和猴眼都可能出現嚴重的炎癥反應，這可能與載體病毒誘導的炎癥前細胞激酶的作用有關。而且，這種炎癥反應是劑量依賴性的，但AAV和LV載體并不誘導炎癥反應。

目前,青光眼基因治療在眼科領域尚處于實驗起始階段,既面臨基因治療普遍碰到的問題,也有青光眼治療中的特殊問題,還有許多理論、技術等方面的問題亟待解決。我們需要更好地理解小梁細胞的細胞外基質，細胞骨架改型和細胞信號事件;更好地理解房水的產生和調節，睫狀上皮釋放的能改變小梁網功能的因子;更好地理解RGC在經受各種刺激和升高與不升高眼壓條件下細胞死亡的激活通路;更好地理解機體對各種載體系統的內在的和抗原特性的免疫反應;更好地理解這些反應在嚙齒類和靈長類動物的差別以減輕這些反應類型。同時需要能夠模仿導致眼壓升高的小梁網和睫狀上皮變化的動物模型以檢測基因治療的效果。努力確認與青光眼相關的其他基因將為更好的基因治療策略提供重要線索。最后，關鍵是要理解為什么源于不同載體的異位基因表達會在不同的眼組織細胞中終止;關鍵是要證實啟動子或其他基因表達元件能夠提供長期的轉基因表達[3]。

總之，隨著分子生物學的飛速發展與基因工程的日新月異,過去的困難現已迎刃而解,相信在不久的將來，青光眼基因治療一定會在臨床上逐步展現其優越性。

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