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          融合蛋白真核醫學

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          融合蛋白真核醫學

          大腸桿菌表達系統最突出的優點是工藝簡單、產量高、周期短、生產成本低。然而,許多蛋白質在翻譯后,需經過翻譯后的修飾加工,如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等過程才能轉化成活性形式。大腸桿菌缺少上述加工機制,不適合用于表達結構復雜的蛋白質。另外,蛋白質的活性還依賴于形成正確的二硫鍵并折疊成高級結構,在大腸桿菌中表達的蛋白質往往不能進行正確的折疊,是以包含體狀態存在。包含體的形成雖然簡化了產物的純化,但不利于產物的活性,為了得到有活性的蛋白,就需要進行變性溶解及復性等操作,這一過程比較繁瑣,同時增加了成本。近年來,以酵母作為工程菌表達外源蛋白日益引起重視,原因是與大腸桿菌相比,酵母是低等真核生物,除了具有細胞生長快,易于培養,遺傳操作簡單等原核生物的特點外,又具有真核生物時表達的蛋白質進行正確加工,修飾,合理的空間折疊等功能,非常有利于真核基因的表達,能有效克服大腸桿菌系統缺乏蛋白翻譯后加工、修飾的不足。因此酵母表達系統受到越來越多的重視和利用(李晶等,1999)。釀酒酵母在分子遺傳學方面被人們的認識最早,也是最先作為外源基因表達的酵母宿主。1981年利用釀酒酵母表達系統表達了第一個外源基因—干擾素基因(Hitzemanetal.,1981),隨后又有一系列外源基因在該系統得到表達(Valenzuelaetal.,1982;Chenetal.,1984;InnisMAetal.,1985;WenDetal.,1986)。1983年美國Wegner等人最先發展了以甲基營養型酵母為代表的第二代酵母表達系統(Wegner,1983)。甲基營養型酵母包括:Pichia,Candida等。以Pichia.pastoris(畢赤巴斯德酵母)為宿主的外源基因表達系統近年來發展最為迅速,應用也最為廣泛。畢赤酵母系統的廣泛應用,原因在于該系統除了具有一般酵母所具有的特點外,還有以下幾個優點(李晶等,1999;歐陽立明等,2000;彭毅等,2000):①具有醇氧化酶AOX1基因啟動子,這是目前最強,調控機理最嚴格的啟動子之一。②表達質粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩定整合。③菌株易于進行高密度發酵,外源蛋白表達量高。④畢赤酵母中存在過氧化物酶體,表達的蛋白貯存其中,可免受蛋白酶的降解,而且減少對細胞的毒害作用。

          Pichia.pastoris基因表達系統經過近十年發展,已基本成為較完善的外源基因表達系統,具有易于高密度發酵,表達基因穩定整合在宿主基因組中,能使產物有效分泌并適當糖基化,培養方便經濟等特點。利用強效可調控啟動子AOX1,已高效表達了HBsAg、TNF、EGF、破傷風毒素C片段、基因工程抗體等多種外源基因(彭毅等,2000;lunwen001etal.,1987;Sreekrishmaetal.,1989),證實該系統為高效、實用、簡便,以提高表達量并保持產物生物學活性為突出特征的外源基因表達系統,而且非常適宜擴大為工業規模(Siegeletal.,1990)。畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種,都具有HIS4營養缺陷標記。其中,GS115菌株具有AOX1基因,是Mut+,即甲醇利用正常型;而KM71菌株的AOX1位點被ARG4基因插入,表型為Muts,即甲醇利用緩慢型,兩種菌株都適用于一般的酵母轉化方法。

          Pichia.pastoris酵母菌體內無天然質粒,所以表達載體需與宿主染色體發生同源重組,將外源基因表達框架整合于染色體中以實現外源基因的表達(楊晟等,2000)。表達載體都是穿梭質粒,先在大腸桿菌復制擴增,然后被導入宿主酵母細胞。為使產物分泌胞外,表達載體還需帶有信號肽序列。