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          多種屬CpG ODN誘導特異性抗體反應
          
						
						
						
						
						
          
						
						
					
          					
					 
           
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          【摘要】目的探討人工合成的CpGODN對不同物種的免疫刺激活性，開發具有廣譜免疫刺激活性的CpGODN。方法將特定的CpGODN單獨或與不同的抗原聯合分別免疫雞和小鼠，用ELISA檢測不同時間雞和小鼠特異性抗體的滴度。結果CpGODN均能誘導雞和小鼠產生抗原特異性抗體，且抗體水平明顯高于對照組(P<0.05)。結論這種CpGODN在一定程度上具有廣譜免疫刺激特性。
           
          【關鍵詞】CpGODN；種屬特異性；疫苗
           
          Abstract:ObjectiveToinvestigatetheimmunestimulationactivityofCpGoligodeoxynucleotidestodifferentspeciesanddevelopCpGoligodeoxynucleotidesthatpossessbroad-spectrumimmunestimulationactivity.MethodChickensandmicewererespectivelyvaccinatedwithCpGoligodeoxynucleotidesorsynergisticallywithdifferentantigens,andthentitersofspecificantibodyinthebloodserumsofchickensandmiceweredetectedwithELISA.ResultsCpGoligodeoxynucleotidescouldinducethegenerationofantigenspecificantibodyinchickensandmice,andthelevelofantibodiesingroupswhichuseCpGODNasadjuvantishigherthanthatinthecontrolgroup(P<0.05).ConclusionCpGODNthatwemaderestrictivelypossessesbroad-spectrumimmunestimulationactivity.
           
          Keywords:CpGODN；multispeciesspecificity；vaccine
           
          包含CpG基序的人工合成的寡核苷酸（ODN）作為免疫刺激信號可以被動物的免疫系統所識別，隨后CpGODN刺激人類和多種動物產生天然的和獲得性的免疫應答。CpGODN主要通過TLR9活化免疫系統，產生Th1型免疫應答。因此，CpGODN作為佐劑已廣泛應用于感染性疾病、腫瘤的預防和治療［1］。但CpGODN存在種屬特異性問題，這一問題限制了動物實驗結論的外推性［2］。所以，尋找和開發具有廣譜識別特性的CpGODN具有重要的應用價值。本文主要通過觀察雞和小鼠血清中特異性抗體的變化來評價CpGODN對不同抗原的免疫增強效果，進而確定這種CpGODN是否能夠克服物種限制性這一問題。
           
          1材料與方法
           
          1.1材料
           
          1.1.1動物健康1日齡小雞，健康50日齡SPF雞，購自廣東省農科院；2月齡BALB/c小鼠,雌性,體質量20g左右，購自南方醫科大學實驗動物中心，合格證號：2003A074。
           
          1.1.2試劑10mg/mL豬囊蟲抗原、豬囊尾蚴DNA疫苗VTS76、VR1020、CpGODN由本實驗室保存［3,4］，SPAHRP購自上海生物制品研究所。
           
          1.2動物分組及免疫方案
           
          1.2.1雞實驗組取健康1日齡小雞，隨機分成A、B、C三個組，每組20只，各組飼養條件相同。7日齡時各組處理如下：A為對照組，不作任何處理；B組滴鼻免疫VTS76疫苗（100μg/kg）；C組滴鼻免疫VTS76疫苗（100μg/kg）,并同時頸部皮下注射免疫佐劑CpGODN（100μg/kg），21日齡時B、C組按相同的處理加強免疫1次。
           
          1.2.2BALB/c小鼠實驗組BALB/c小鼠60只,隨機分為3組,每組間隔2周免疫2次。采用肌肉注射法,將質粒DNA溶液注射到小鼠兩側股四頭肌。A組注射VR1020100μg/kg作為陰性對照;B組注射VTS76（100μg/kg）;C組注射VTS76和CpGODN各100μg/kg。
           
          1.3抗原特異性抗體檢測96孔培養板用碳酸氫鈉緩沖液(15mmol/LNa2CO3,35mmol/LNaHCO3,PH9.6)適當稀釋的豬囊蟲抗原包被，4℃過夜孵育。用含Tween20的PBS(0.1mol/LPBS，0.1%Tween20)洗滌3次，每次3min；每孔加入100mL經PBS(0.1mol/LPBS，1%BSA)適當稀釋的待測血清，37℃孵育2h。PBS洗滌5次，每孔加入100mL、1∶40稀釋的SPAHRP，37°C孵育2h。PBS洗滌5次，每孔加入100mLTMB底物（含0.1mg/mL3’3’5’5’四甲基聯苯胺的磷酸鹽檸檬酸緩沖液，pH5.4，用前加5mL30%H2O210mL），37℃孵育1h。每孔加入50mLH2SO4(0.2mol/L)終止顯色反應。BioRad3550測定A450讀數。待測樣品A值大于陰性對照平均A值的3倍為陽性。
           
          1.4統計學分析各實驗組數據比較均采用方差分析，P<0.05為差異有顯著性。
           
          2結果
           
          2.1CpGODN對雞血清中豬囊尾蚴特異性抗體滴度的影響C組在初次免疫1周后可以檢測到特異性抗體，但抗體滴度很低；在初次免疫2周和二次免疫1周后，B組和C組特異性抗體滴度明顯上升，且C組顯著高于B組(P<0.05)；二次免疫后2周，B組還有明顯上升，而C組已進入平臺期，維持在一個較高的水平，兩組之間差異無顯著性(P>0.05)。對照A組在各個時間點均未檢測到特異性抗體。以上結果表明，CpGODN能夠顯著增強VTS76疫苗誘導的體液免疫應答水平。見圖1。
           
          圖1免疫雞特異性抗體滴度的動態變化（略）
           
          Fig.1Dynamicchangesoftitersofspecificantibodyagainstofimmunizedchickens
           
          2.2CpGODN對小鼠血清中豬囊尾蚴特異性抗體滴度的影響B組和C組在初次免疫1周后可以檢測到特異性抗體，但抗體滴度很低(1∶20)。二次免疫后1周，B組和C組免疫小鼠的抗體滴度均明顯上升，但差異無顯著性(P>0.05)。二次免疫后的第2周到第3周，C組的特異性抗體滴度明顯高于B組(P<0.05)。對照A組在各個時間點均未檢測到特異性抗體。結果表明，CpGODN能夠顯著提高豬囊尾蚴DNA疫苗的體液免疫應答水平。見圖2。
           
          圖2免疫小鼠特異性抗體滴度的動態變化（略）
           
          Fig.2Dynamicchangesoftitersofspecificantibodyofimmunizedmice
           
          3討論
           
          CpGODN的種屬特異性是指特定序列的CpGODN僅對特定種屬的免疫細胞具有免疫刺激活性。早期研究發現，對人類TLR9產生最佳刺激效果的CpG基序是GTCGTT，而對小鼠TLR9最佳的CpG基序是GACGTT。將對人免疫細胞具有強刺激活性的ODN作用于鼠的免疫細胞時，僅顯示出很弱的免疫活性，甚至無免疫活性，反之亦然［5］。CpGODN的種屬特異性與TLR9的有效識別有關，即特定種群的TLR9僅識別特異的CpGODN序列。研究還發現，TLR9單個氨基酸的改變都會影響CpGODN的免疫刺激效果［6］。
           
          目前，對于TLR9對ODN的識別方面有了更深入的認識。由于天然的磷酸二酯(PD)修飾ODN易于降解，所以目前應用較多的CpGODN均為磷硫酰（PS）修飾的ODN。而TaraLR［7］認為TLR9識別CpG基序的物種特異性僅限定于磷硫酰（PS）修飾的ODN，而天然的磷酸二酯骨架卻不受影響。因此，人類和小鼠的細胞并沒有進化到可以識別天然DNA中不同的CpG基序。我們采用的CpGODN是將60bp磷酸二酯（PD）修飾的ODN與pUC18載體體外連接，構建為重組質粒pUC18ODNs。這種磷酸二酯（PD）修飾的ODN可能更真實地模擬天然的包含CpG基序的非甲基化的ODN，克服TLR9識別CpG基序的物種特異性，從而提高自身對多種屬的免疫刺激活性。
           
          KandimallaER［8］設計了一種具有潛在的免疫刺激活性并能克服物種特異性識別效應的二核苷酸基序RpG。包含GARGTT和GTRGTT基序的ODN能夠活化J774細胞的NFκB通路，同時誘導小鼠和人類細胞分泌大致相等水平的細胞因子。與CpGODN相比，RpGODN能夠同時被HEK293細胞中的小鼠TLR9所識別。該種RpGODN還能誘導其它多個物種的外周血單個核細胞的增殖。此研究揭示了我們可以通過對寡核苷酸進行結構改造或修飾繞過TLR9識別的物種限制性，達到誘導多種屬產生免疫應答的目的。
           
          本研究結果表明，本研究所制備的CpGODN能夠同時提高雞和小鼠的體液免疫應答水平，這一研究結果為開發具有廣譜免疫識別特性的CpGODN提供了重要的線索。當然，目前的研究還有待進一步深入，包括擴大物種的實驗范圍（特別是哺乳動物），同時研究體液免疫和細胞免疫應答水平。
           
          【參考文獻】
           
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