紅樹林內生真菌抗細菌和抗真菌活性

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【摘要】目的分離和篩選具有抗細菌和抗真菌活性的紅樹林內生真菌。方法從紅樹林植物桐花樹、海漆、秋茄、木欖、白骨壤、銀葉樹中分離到60株內生真菌，對其代謝產物進行抗菌檢測，通過濾紙片法來檢測內生真菌代謝產物抗細菌和抗真菌活性。結果共有35株內生真菌具有抗細菌活性，占待側菌株總數的58.3％，其中以不產孢類、青霉屬、曲霉屬、鐮孢屬為主，分別占活性菌株總數的51.4％、8.6％、8.6％、8.6％；共有49株內生真菌具有抗真菌活性，占待側菌株總數的81.7％，其中以不產孢類和盤長孢屬為主，分別占活性菌株總數的44.9％、17.1％。結論紅樹林內生真菌是抗菌活性物質的一個潛在的、豐富的資源庫，值得進一步研究和開發。

【關鍵詞】紅樹林；內生真菌；代謝產物；生物活性

Abstract:ObjectiveToisolateandscreenfungalendophyteswithantibacterialandantifungalactivitiesfrommangroveplants.MethodsTheantibacterialandantifungalactivitiestestoffungalendophytesfrommangroveplantswereusedbypaperdiscmethod.ResultsSixtystrainsofendophyticfungiwereisolatedfromAegicerascorniculatum,Excoecariaagallocha,Kandeliacandel,Bruguieragymnorrhiza,Avicenniamariana,Heritieralittoralis.Theresultoftheantibacterialandantifungalassayshowsthatthirtyfivestrainsoftheendofungi(58.3%oftotaltestedstrains)haveantibacterialactivities,theactivestrainsmostlybelongtosterilegroups(51.4%ofactivestrains),Penicillium(8.6%),Aspergillus(8.6%),Fusarium(8.6%);fortyninestrains(81.7%oftotaltestedstrains)haveantifungalactivites,mostofthembelongtosterilegroups(44.9%ofactivestrains),andGloeosporium(17.1%).ConclusionMangrovefungalendophyteswerepotentialandrichresourcesofantimicrobialcompounds,whichneedtoexplorefurther.

Keywords:mangroveplants,fungalendophytes,metabolites，bioactivity

內生真菌(endophyte)指生活于健康植物組織內部、不引發植物產生明顯病癥的一類真菌。但在植物衰老或外界刺激條件下，植物自身免疫力下降，也可能出現某些病癥。它們全部或部分生活周期生活在植物組織內。這類真菌生活在植物體這一特殊生境中，不但能促進植物的生長發育［1］，提高宿主植物對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力［2］，還能產生多種具有生物活性的次生代謝產物，在醫藥業、農業的生物防治方面都顯示出重要的應用價值［3］。

1993年,Strobel等［4］等從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)的韌皮部中分離到一株能產紫杉醇（Taxol)的內生真菌（Taxomycesandreanae)，受此啟發,國內外學者也相繼在其他陸生植物開展此方面的研究，并從中分離具有多種具有抗腫瘤活性、抗真菌活性、免疫抑制活性的內生真菌［5,6］。紅樹林作為生長在熱帶和亞熱帶海灣河口潮間帶的一種特殊的生態系統，一直處于高鹽、頻繁的潮汐、強風、高溫、強紫外輻射和缺氧污泥的海陸潮間帶環境［7］，其生境非常特殊，研究發現它們自身許多成分也具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤等藥用價值［8］。它們的內生真菌同時又具有海洋微生物的特點，這也使得紅樹林內生真菌具有獨特的代謝途徑和遺傳背景，其種類和產物化學類型多樣性也比較豐富，因此有可能從中發現一些新的真菌種類和新的代謝產物。本研究對深圳福田紅樹林自然保護區的6種紅樹林的內生真菌進行了較為系統的分離，并從中篩選具有抗菌活性的菌株，為開發新的抗菌藥物提供基礎。

1材料與方法

1.1植物樣品來源

在深圳福田紅樹林保護區采集桐花樹（Aegicerascorniculatum）、海漆（Excoecariaagallocha）、秋茄（Kandeliacandel）、木欖（Bruguieragymnorrhiza）、白骨壤（Avicenniamariana）、銀葉樹（Heritieralittoralis）的葉、莖、根、樹皮、氣生根等樣品，采集后放于冰盒中保存,4h內處理樣品，進行內生真菌的分離。

1.2培養基

1.2.1PDA培養基

馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂15g,50％人工海水1000mL。

1.2.2真菌發酵培養基

2％葡萄糖，1％蛋白胨，0.5％酵母膏，50％的人工海水，pH6.5。

1.2.3LB培養基

稱取10g蛋白胨、5g酵母膏、10gNaCl，加蒸餾水溶解后，調pH至7.4，定容至1000mL。

1.2.4促孢培養基

KH2PO41g,KNO31g,MgSO4·7H2O0.5g,KCl0.5g,淀粉0.2g,葡萄糖0.2g,蔗糖0.2g,瓊脂15g,水1000mL。

1.3拮抗試驗菌株

1.3.1試驗細菌

金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusNICPBP26112)，枯草芽孢桿菌(BacillussubtilusMIG1.22)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC8739)、青枯菌（Ralstoniadolaanacearum）分離于番茄植株。

1.3.2試驗真菌

假絲酵母菌(CandidaalbicansATCC10231)，釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeMIG2.34)均購自廣東省微生物研究所。新月彎孢霉(Curvularialunata)由本實驗室保存；茄絲核菌（RhizoctoniasolaniK）分離于患病番茄植株；葉枝霉(Cladosporiumherbarum)分離于患病番茄植株；尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)分離于香蕉植株。

1.4植物內生真菌的分離

葉、葉脈、莖、樹皮（韌皮部）等樣品用自來水沖洗掉泥土，然后進行嚴格的表面消毒程序：依次浸泡在75％酒精1min，3%～5%有效氯的次氯酸鈉溶液3min，75%的酒精0.5min，然后再用無菌水沖洗3遍。晾干后，在超靜臺將其剪成約0.5cm×0.5cm左右小片。將處理好后剪成的小片鋪于PDA平板上，加入氯霉素與鏈霉素各50μg/mL抑制細菌的生長，在26℃培養培養2～3周分離內生真菌。這些平板在第1周要每天檢查1次，然后可以3、4d檢查1次。一旦發現有菌絲從組織小塊長出，應馬上將其轉接到另一新的平板上，經幾次純化保存于PDA斜面。

1.5表面消毒效果檢查

參考文獻［9］方法觀察表面消毒效果。

1.6內生真菌的鑒定

使用PDA培養基,采用載玻片法培養內生真菌,根據《真菌鑒定手冊》［10］中描述的真菌形態特征進行鑒定。不產孢子的菌株，需使用催孢培養基或紫外線照射來誘導孢子的產生。仍不產孢者歸不產孢類。

1.7內生真菌發酵及代謝物提取

分離到的紅樹林內生真菌斜面培養物經活化后分別接種至20mL真菌發酵培養基，26℃搖床上以190r/min的轉速培養7～10d，發酵結束后將發酵物冷凍干燥，再用10mL甲醇浸泡抽提1d。取甲醇提取液清液，揮發干后，用2mL甲醇溶解配成10倍濃縮液。

1.8內生真菌代謝物抗細菌、抗真菌活性檢測

采用濾紙片法進行抗菌活性檢測:活化后的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌與青枯菌培養液用無菌水稀釋至10-4，取0.1mL菌懸液（約105cfu/mL）涂布于LB平板上。用濾紙片（直徑5mm）吸取內生真菌代謝產物粗提物溶液，放置于平板上，37℃培養1～2d，觀察抑菌圈的大小及有無。白色念球菌除取10-3稀釋液200μL涂布PDA平板外，其余均與細菌相同，并用空白濾紙片吸取甲醇溶液作為空白對照；將絲狀病原真菌接種于PDA培養基平板中央，在病原菌周圍放置用粗提物浸過的濾紙片，培養3～5d后觀察病原菌菌落生長情況，并用空白濾紙片吸取甲醇溶液作為空白對照。

2結果

2.1紅樹林內生真菌的分離

本研究從深圳福田紅樹林保護區的6種紅樹林多個部位共分離到60株內生真菌作為抗細菌活性和抗真菌活性的待篩菌株，并對它們進行了分類鑒定，結果見表1。從表1可以看出，分離到60株紅樹林內生真菌包括11個屬和不產孢類，其中以不產孢類、盤長孢屬、鐮孢屬、曲霉屬為主要類群，分別占45.0％、11.7％、8.3％、8.3％。

表160株待篩菌株種類及來源（略）

Tab.1Thetaxaandoriginof60endophyticfungiwhicharescreened

2.2紅樹林內生真菌的抗細菌活性

從表2可以看出，在60株待篩紅樹林內生真菌中，有35株內生真菌的代謝產物對一種或多種指示細菌有抑制活性，占待篩菌株的58.3％，這說明紅樹林內生真菌存在著豐富的抗細菌資源。

2.3紅樹林內生真菌的抗真菌活性

紅樹林內生真菌對細菌的拮抗實驗結果見表2。從表2可以發現，60株待篩紅樹林內生真菌甲醇代謝產物有49株（占81.7%）的代謝產物具有抗真菌活性；其中有42株內生真菌的代謝產物對絲狀真菌具有抗性，占待側菌總數的70.0％；有22株紅樹林內生真菌的代謝產物對人類皮膚深部感染病菌－假絲酵母菌有抗性，占待側菌總數的36.7％。實驗結果表明，紅樹林內生真菌蘊藏著豐富的抗真菌活性物質產生菌，是開發抗真菌藥物的潛在資源。

2.4內生真菌抗菌活性菌株屬的分布

從表3可以看出：紅樹林內生真菌中具抗細菌活性的菌株分布在9個屬中，其中以不產孢類、青霉屬、曲霉屬、鐮孢屬為主，各占活性菌株總數的51.4％、8.6％、8.6％、8.6％；紅樹林內生真菌具抗真菌活性的菌株分布在12個屬中，以不產孢類（44.9％）和盤長孢屬（17.1％）為主。以上結果表明，內生真菌抗菌活性菌株的種屬分布具有多樣性。

3討論

過去篩選產生抗菌物質微生物的重點一直是土壤微生物，特別是鏈霉菌。但自20世紀60年代以來，從鏈霉菌中被重復發現的抗生素高達95%，篩選得到的有價值的抗生素比率逐年下降。于是人們將篩選抗菌物質的注意力逐漸集中于其他生態系統的生物，尤其是那些特殊生境的微生物如海洋微生物、植物內生菌等。近年來的研究表明,海洋微生物是新物質的巨大寶庫，人們在海洋中找到了大量結構新穎，且活性很強的生物活性物質，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤等物質［11］；植物內生菌作為一種特殊生境的微生物也同樣具有豐富的生物功能多樣性，在生物控制、無公害農業和醫藥開發方面有著很好的開發前景。紅樹林作為生長在熱帶和亞熱帶海灣河口潮間帶的特殊生態系統，其生境非常特殊，其體內的內生真菌既是植物內生菌，又具有海洋微生物的特點，這也造就了紅樹林內生真菌具有獨特的代謝途徑和遺傳背景，因此對它們的代謝產物進行研究可能會有可喜的發現。本研究結果表明，紅樹林內生真菌具有廣泛的抗菌活性：抗細菌活性菌株占58.3％；抗真菌活性菌株占81.7％，其中70%菌株的代謝產物對絲狀真菌具有抗性，36.7％對人類皮膚深部感染病菌－假絲酵母菌有抗性。內生真菌的屬種分布和拮抗作用具有多樣性：分離到60株紅樹林內生真菌除不產孢類外，分布于11個屬，其中不產孢類、盤長孢屬、鐮孢屬、曲霉屬為主要類群；紅樹林內生真菌中不產孢類抗微生物活性所占比例明顯較高，不同屬種的菌株對同一指示菌的抗菌作用有較大差別,對金黃色葡萄球菌和茄絲核菌有拮抗作用的菌株種類較多，同屬的內生真菌對的病原菌拮抗作用及抗菌效果也各不相同。植物內生真菌及其抗微生物活性的多樣性為人們開發抗菌藥物提供了重要的資源保證。

在對紅樹林內生真菌的抗真菌活性研究發現，其抗真菌活性菌株比例比從水稻、香蕉等分離到的內生真菌和其他陸生植物內生真菌（特別是抗絲狀真菌）都要高［12-14］。這說明紅樹林內生真菌可能比其他環境中的真菌蘊含著更為豐富的抗真菌活性的資源。由于真菌感染是人類面臨的一個越來越嚴重的一個健康問題，特別是對于艾滋病人和其他免疫力低下的患者，開發出新的抗真菌感染的藥物顯得尤為重要。植物真菌致病菌如茄絲核菌、尖孢鐮刀菌、新月彎孢霉等都能引起多種植物的病害，而且目前沒有有效又環保方法防治，而植物內生真菌作為生物農藥的生物防治方法為此提供了一個新途徑。本研究結果表明，許多紅樹林內生真菌產生的代謝產物不僅對植物絲狀病原真菌表現出有著抗性而且對人類致病真菌也存在抗性，它們為開發新的抗真菌感染的藥物以及植物真菌病的生物防治提供了重要的資源庫，表現出良好的應用前景，值得進一步深入的研究。

表2紅樹林內生真菌代謝物的抗細菌活性和抗真菌活性（略）

Tab.2Antibacterialandantifungiactivitiesofendophyticfungifrommangroveplants

根據抑菌圈直徑比較活性,0：無抑制活性；+：≤10mm；++：10～20mm；+++：≥20mm

表3紅樹林內生真菌抗菌活性菌株屬的分布（略）

Tab.3Proportionoftaxaofmangroveendophyticfungiofantimicrobialactivities

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