燈盞花素磷脂對鼠腦缺血灌注損傷

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【摘要】目的觀察燈盞花素磷脂復合物(BerPC)對腦缺血再灌注大鼠腦損傷的影響。方法復制大鼠大腦中動脈腦缺血再灌注損傷模型，觀察缺血后大鼠神經功能障礙情況，測定再灌注后缺血側腦梗死范圍及腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPX)的活性及丙二醛（MDA）的含量。結果BerPC劑量依賴性減輕腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能障礙，減少腦梗死面積，拮抗缺血腦組織MDA含量的增加，提高腦組織SOD、GSHPX活性。結論BerPC對腦缺血再灌注損傷大鼠具有明顯的保護作用，具有良好的新藥開發前景。

【關鍵詞】燈盞花素磷脂復合物；腦缺血；再灌注；大鼠

Abstract:ObjectiveTostudytheprotectiveeffectsofbreviscapinephosphatidylcholinecomplex(BerPC)againstbraininjuryinratsundergonefocalischemiareperfusion.MethodsWistarratsweretreatedwithBerPCfor14daysandweresubjectedtofocalischemiareperfusionbymiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)usingintraluminalthread.After2hoursofMCAOreperfusionwasallowedbyretractingthethread.Thenervesymptomswereobservedafter1hourofreperfusionandtheinfractedarea,thelevelofMDA,theactivityofSOD,andGSH-PXinischemicbraintissuewereobservedafter24hours.ResultsBerPCcouldimprovebehaviordisorderinducedbyMCAOandreducebraininfractedareathroughincreasingtheactivityofSODandGSHPX,decreasingthelevelofMDAinbraintissue.ConclusionBerPCcouldprotectagainstfocalbraininjuryinducedbyreperfusioninjuryinmiddlecerebralarteryofratsandcouldbeapromisingproduct.

Keywords:Breviscapinephosphatidylcholinecomplex；cerebralischemia；perfusion;rat

燈盞花素(Ber)是從菊科植物短葶飛蓬中提取的有效活性成分，是治療心腦血管疾病的常用天然藥物。它能有效清除氧自由基和過多的NO，防止腦缺血造成的細胞膜離子轉運紊亂，阻止細胞內鈣超載，保護腦細胞，增加腦血流量，改善腦血管循環等［1，2］。但其結構特點決定其口服不易吸收，生物利用度較低［3］。因此筆者將燈盞花素與磷脂(PC)復合，形成燈盞花素磷脂復合物(BerPC)，以提高生物利用度，改善臨床療效。本實驗研究BerPC對大鼠腦缺血再灌注(IR)損傷的保護作用，并與Ber進行比較，旨在為新藥開發提供藥效學依據。

1材料與方法

1.1藥物與試劑

Ber（云南植物藥廠，批號000908），PC（上海試劑二廠，批號031104）。BerPC由武漢俊民醫藥研究所提供，批號010311，其制備方法為：取Ber溶于丙酮中，加溫至60℃促溶，以質量比1∶1.6比例加入大豆磷脂，攪拌2.5h后，揮除有機溶劑，殘余物室溫減壓干燥10h后得磷脂復合物。三苯基氯化四氮唑(TTC)染液（中國醫藥集團上海化學試劑公司，批號010411）。考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（批號030307），超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒（批號030704），谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPX)測定試劑盒（批號030715），丙二醛(MDA)測定試劑盒（批號030715）均為南京建成生物工程研究所產品。

1.2動物

Wistar大鼠，雄性，體質量300～350g，10～12月齡，由武漢大學醫學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（鄂）2003-0002。

1.3儀器

754紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司分析儀器廠），BPS130電子分析天平（北京賽多麗斯天平有限公司），電熱灼燒器（上海醫療器械八廠生產）。

2實驗方法

2.1分組及給藥

取上述大鼠70只，隨機分為7組，每組10只，即單純缺血再灌注(IR)組及假手術（Sham）組；Ber200mg·kg-1組；BerPC50、100、200mg·kg-1組（劑量以Ber計）；PC320mg·kg-1組（相當于BerPC200mg·kg-1組中PC的量）。其中Sham組及IR組均給予等體積的0.5%CMC（10mL·kg-1）溶液。動物每天灌胃給藥1次，連續給藥14d。

2.2大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的制備［4］

末次給藥后1h，大鼠稱重，腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液1mL·kg-1麻醉，仰臥固定于恒溫手術臺上。頸部皮膚正中切口，分離左側頸總動脈及其分支。將直徑為0.26mm，頭端灼燒膨大且光圓的尼龍線經頸總動脈插入頸內動脈入大腦中動脈分支處，進線深度均距頸內、頸外動脈分叉18mm處，阻斷左側大腦中動脈血流2h，拔出尼龍線予以再灌注24h，Sham組僅手術分離，不插尼龍線。

2.3對大鼠神經功能的影響

大鼠清醒后，觀察其行為學變化，神經癥狀按文獻［4］5級4分制評分。評分標準：無神經損傷癥狀為0分；不能完全伸展右側前爪為1分；向右側轉圈為2分；行走時向右側傾倒為3分；不能自發行走或意識昏迷為4分。

2.4對大鼠腦梗死面積的影響

各組大鼠再灌注24h后，開顱取腦，取梗死側腦組織冰浴上（4℃以下）冠狀切成5片，迅速將腦片置于2%TTC染液中，37℃染色20min，10%（φ）甲醛固定。經染色后非缺血區腦組織呈玫瑰紅色，梗死區呈白色，將白色組織挖下稱重。以梗死區腦質量與總切片腦質量的百分比作為梗死范圍。

2.5對SOD、GSHPX活性及MDA含量的影響

各組大鼠于再灌注24h后，取缺血側同一部位腦組織用0.9%冰氯化鈉溶液制成10%腦組織勻漿，將勻漿以3000r·min-1離心10min，取上清液，按試劑盒說明書操作，分別測定SOD、GSHPX活性及MDA含量。以牛血清白蛋白為標準品，用考馬斯亮藍法測定各樣品中蛋白質含量。

2.6統計學處理

實驗數據以±s表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05認為差異有顯著性。

3結果

3.1對神經功能評分的影響

與Sham組比較，IR組大鼠出現明顯的神經功能障礙。腹腔注射BerPC50、100、200mg·kg-1，連續14d，可劑量依賴性降低大鼠神經功能評分，且100、200mg·kg-1組與IR組比較，差異具有極顯著性（P<0.01）。與Ber組相比較，BerPC200mg·kg-1組作用明顯強于相同劑量的Ber組（P<0.01），見表1。

表1對腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能的影響略

3.2對腦梗死面積的影響

與Sham組比較，IR組大鼠腦梗死面積百分率顯著增加（P<0.01），顯示缺血再灌注引起腦組織明顯壞死。腹腔注射給予BerPC50、100、200mg·kg-1，連續14d，可劑量依賴性縮小腦梗死面積，且50、100、200mg·kg-1組與IR組比較，差異具有極顯著性（P<0.01）。且BerPC200mg·kg-1組作用明顯強于相同劑量的Ber組（P<0.01）。見表2。

3.3對SOD、GSHPX活性及MDA含量的影響

與Sham組比較，IR組SOD、GSHPX活性明顯降低，MDA含量顯著升高(P<0.01)。與IR組比較，Ber組、BerPC3個劑量組SOD活性顯著升高，差異有顯著性（P<0.05或P<0.01），且BerPC200mg·kg-1組作用明顯強于相同劑量的Ber組（P<0.05）。與IR組比較，Ber組、BerPC3個劑量組GSHPX活性顯著升高，差異有顯著性（P<0.05或P<0.01）。與IR組比較，所有給藥組MDA含量均顯著降低，差異有極顯著性（P<0.01）。見表3。

表2對大鼠腦梗死面積的影響略

表3對SOD、GSHPX活性及MDA含量的影響(略)

4討論

在缺血性腦損傷的過程中，由于大量自由基產生，導致膜脂質發生過氧化，破壞了膜脂質的代謝和結構，從而改變酶蛋白的微環境。另一方面，自由基也可直接氧化酶蛋白氨基酸殘基，引起酶蛋白構象改變，使酶失活。GSHPX在細胞質中直接參與清除H2O2，SOD能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。大鼠腦缺血后，SOD和GSHPX活性明顯低于正常，清除自由基能力下降，導致脂質過氧化產物MDA生成增多。從本文結果看：預先給予BerPC可明顯減輕大鼠缺血后的行為障礙，減小腦梗死體積百分比，明顯降低SOD和GSHPX的活性抑制，減少MDA的生成，與文獻［2］報道Ber藥理作用基本一致，顯示BerPC對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用與其抗脂質過氧化有關。細胞膜離子轉運紊亂，細胞內鈣離子超載是引起腦缺血再灌注的重要因素，BerPC對細胞內鈣離子的影響，我們將另行研究。

燈盞乙素是Ber的主要有效成分之一，為黃酮木脂素類化合物，其結構決定Ber溶解度較低，口服不易吸收，這在一定程度上影響了其療效的發揮。磷脂為體內細胞膜的基本組成物質，與細胞膜的親合力強。文獻［5］報道，磷脂在一定條件下與天然活性成分藥物進行復合,得到天然活性成分磷脂復合物(phytosomes),其理化性質和生物特性較原化合物均有不同程度的改變。phytosomes以磷脂作載體，可以使黃酮類化合物很容易透過細胞的脂質膜，顯著地改變其生物有效性。本文實驗證實了BerPC的藥理作用明顯強于等劑量的Ber，且PC無明顯的藥理作用，提示Ber和磷脂形成一種全新的復合化合物，可能提高了Ber的生物利用度。

【參考文獻】

［1］萬海同，王玉.燈盞花素治療腦缺血作用的研究進展［J］.浙江中醫學院學報，2006，30(1)：101-103.

［2］何蔚，曾繁典.燈盞花素治療缺血性腦血管病的藥理作用和臨床研究［J］.中國臨床藥理學雜志，2002，18(6)：458-461.

［3］葛慶華，周臻，支曉瑾.燈盞花素在犬體內的藥動學和絕對生物利用度研究［J］.中國醫藥工業雜志，2003，34(12)：618-621.

［4］ZEALONGAEL，WEINSTEINPR，CARLSONS,etal.Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyintherats［J］.Stroke，1989，20(1)：84-88.

［5］凌沛學，湯漩，王鳳山，等.藥物與磷脂復合物研究近況［J］.中國藥學雜志，2005，40(6)：401-402.