多腫瘤抑制基因p6和腫瘤關系
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【關鍵詞】多腫瘤
癌癥是人類面臨的最大難題，隨著分子生物學和基因工程的進展，使我們認識到腫瘤發生的關鍵是正常細胞內基因組發生了改變，基因改變是導致腫瘤的根本原因［1］。近期的研究結果顯示從腫瘤的誘發到進展是一個多階段、多因素的復雜過程，這個復雜過程包括腫瘤基因的激活和腫瘤抑制基因的失活，腫瘤基因和腫瘤抑制基因分別以正性和負性調節細胞的生長，并參與腫瘤的形成［2］。到目前為止，人類已發現100多個癌基因和10多種抑癌基因。80年代中期抑癌基因被發現以來，其重要作用得到廣泛認可，抑癌基因(tumorsupressgene)是正常細胞在調控細胞增殖、分化等方面起重要作用的基因，它在保持基因組結構穩定、促進細胞生長、誘導細胞凋亡等方面均有重要意義，它的缺失或失活可引起細胞內癌基因(oncogene)的活化，造成細胞的過度增生、分化，導致惡性腫瘤的發生和發展。癌基因和抑癌基因共同參與調節細胞周期活動的分子過程已為現今癌癥研究的重要課題之一。研究腫瘤發病的分子生物學機制，了解各種腫瘤細胞增殖周期中調控因子的狀況，對于進行基因診斷、基因治療無疑具有重大意義。
1p16(MTS1)基因的發現和基本結構
1992年美國Skolnick等在黑色素瘤患者中發現有與細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)相結合的蛋白，但這種蛋白的基因未被克隆出，隨后對100個黑色素瘤細胞系采用染色體步移法和序列標記位點圖進行分析，發現1/2的腫瘤細胞在染色體9p21區發生頻繁的基因突變，推測該區域含有黑色素瘤的易感基因［2］，此后在許多人類腫瘤集及體外細胞系中均發現9p21區的缺失和突變。1993年，美國長島冷泉實驗室研究的細胞先驅Serano等利用酵母雙雜和蛋白相關性篩選法(yeasttwo-hybridproteininteractionscreen)發現并分離了特異性的細胞周期素依賴性激酶4(CDK4)抑制蛋白(CDK4I)-p16蛋白，證明p16與CDK4結合后cyclinD/CDK4復合物的催化作用明顯降低，并克隆了p16的cDNA。1994年美國鹽湖城Kamb等［3］和圣地亞哥的Nobori［4］分別報道發現一個新的抑癌基因：p16，兩個研究小組發表了一項重要的研究成果發現一個新的抑癌基因：p16蛋白，證明p16與CDK4結合后cyclinD/CDK4復合物的催化作用明顯降低，并克隆了P16的cDNA。Kamb［3］在對黑色素瘤染色體9p21易感區應用物理圖(physicalmap)和序列標記位點圖(sequencetaggedstites,STSs)分析了100個黑色素瘤細胞系的純合缺失，發現在兩個區域與Serrano報道的p16序列相近，命名為多發性腫瘤抑制因子1(multipletumorsuppress1,MTS1)和MTS2，其中MTS1和p16完全吻合，而MTS2與p16序列有93%相同，現命名為p15(kambA.S
cience,94,264,436-440)。p16基因位于人類的9號染色體短臂(9p21)上，由3個外顯子和2個內含子組成，外顯子1包括E1α和E1β，E1α，126bp；E1β，180bp；外顯子2307bp；外顯子311bp。全長8.5kb，氨基酸序列分析表明成熟的p16分子量為15.84kD的單鏈多肽，含有一個由148個氨基酸組成的開放閱讀框架，具有一個有4個ankyrin序列組成(回鉤狀重疊的空間構型的蛋白結構)，這一構型為維持其活性所必需，參與蛋白與蛋白之間的作用［4］。
2作用機制
細胞增殖分裂是細胞最基本的生理活動，越來越多的研究證明，細胞分裂周期的精確性及定時性是正常細胞生長和分化所必需的，細胞作為機體的最小單位，其生長過程總是處于一種增殖的動態平衡之中，這才能保證機體正常的生長、發育。這就意味著細胞內必然存在著促進和抑制增殖兩種體系［5］，包含于這一過程中的蛋白質及基因的改變與腫瘤發生及其惡性表形密切相關。典型的一個細胞周期包括有嚴格順序的4個期即G1SG2M，它是由MPF(maturationpromotingfactor,MPF)所推動。并受到信號轉導途徑和反饋環路的精密調控。MPF含兩種蛋白質組分，其一為cdc2蛋白(celldivisioncycle2protein)，另一為細胞周期蛋白(cyclin)，在整個細胞周期中cdc2蛋白的濃度是穩定的，它的活動受到細胞周期蛋白的調節，細胞是否進入分裂周期以及分裂周期是否成功完成取決于其能否順利通過若干關卡(checkpoints)，其中最重要的是G1/S轉換和G2/M轉換。前者又稱為“啟動點(start)”或“限制點(restrictionpoint)”，位于G1期末，DNA合成的起始，后者位于M期的初始。現已證明，激活的CDK在這兩個轉換過程中起關鍵作用［6］。在高等的真核細胞，細胞周期蛋白分為A、B、C、D、E五種，它們分別在細胞周期的不同時期積累，激活相關細胞周期蛋白激酶(CDK)，使之具有蛋白激酶活性。G1期細胞周期蛋白是指在G1或G1/S交界處發揮作用啟動細胞周期并促進DNA合成的周期蛋白，有C、D、E等多種，其中cyclinD1能激活CDK4、6調節G1/S轉換，促進細胞分裂周期由G1期進入到S期，進行DNA合成［7］，cyclinD實際上可以視為一種癌基因，其過度表達會導致細胞增殖失控。最重要的研究發現是CDK抑制因子與腫瘤生長密切相關，對于CDK抑制因子p21的研究首先證明了這一點，p21是作為含有PCNA(proliferatingcellnuclearantigen)在內的CyclinD-CDK四聚體復合物中的一員在正常人纖維母細胞中首先被發現的［7］。對p16的研究進一步闡明了CDK抑制因子在腫瘤發生發展中的作用。這就構成了cyclins(細胞周期素)-CDKs(細胞周期素依賴性蛋白激酶，cyclinsdependentkinases)-CKIs(細胞周期素依賴性蛋白激酶的抑制蛋白，cyclinsdependentkinasesinhibitors)這一以CDKs為中心的細胞周期網絡調控系統。p16通過與cyclinD競爭結合CDK4、CDK6抑制cyclinD/CDK4的活性，參與并調節細胞從G0期進入G1期，去除p16的抑制作用，將使細胞異常增殖，過度周期蛋白激活和/或抑制蛋白的失活，都會導致CDKs的過度作用，導致細胞非正常增生。野生型抑癌基因Rb的蛋白產物PRb的活性是通過磷酸化作用獲得的，CDK4、CDK6作為PRb的激酶與此密切相關，Liu等［8］提出PRb發生磷酸化后，導致與PRb結合的TF(TranscriptionFactor)的釋放，如E2F，E2F是通過激活與細胞增殖有關的基因，如DNA合成酶-α，從而調控細胞周期由G1期到S期，E2F與未磷酸化的PRb結合時沒有轉錄活性，但與磷酸化的PRb分離后將激活p16基因轉錄，隨著p16mRNA水平的增多，和CDK4、CDK6結合的p16也增多，致使cyclinD/CDK4、CDK6的激酶活性受到抑制，低磷酸化的PRb為其活性狀態，PRb磷酸化水平下降，p16基因的錄也隨之降低［8］。JosephGeradts等［9］在實驗中證實，在人類許多腫中，Rb過表達的細胞系都伴有p16表達下降，反之亦然。在p16過表達的細胞系無一例外地有Rb蛋白和/或p53蛋白失活，而Rb蛋白的失活對p16更有直接作用，Rb蛋白可抑制p16蛋白表達，進一步影響cyclinD表達［10］。Beach等［11］認為正常細胞中存在著一個由Rb、p16、cyclinD/CDK4、CDK6共同組成的反饋調節圈。p16在正常細胞調控周期中起負反饋作用，p16基因影響Rb基因在細胞增殖中的調節作用，結合細胞周期的研究，在G1/S轉化過程中，PRb由于磷酸化失活，失活的PRb一方面促進細胞進入S期，另外PRb通過轉錄因子，如E2F促進p16的轉錄，反而又抑制cyclinD-CDK中間的反饋作用，而達到對細胞從G1期到S期的轉變過程的調控。除此之外，p53對p16的表達也起負向調節作用。目前發現的細胞周期抑制蛋白根據其結構和功能分為兩類：一類包括p15、p16、p18、p19；另一類包括p21、p27。它們對細胞增殖起負調控作用［8］。p16外顯子1包括E1α和E1β兩種，p16β是p16的另一個選擇替換轉錄模本，它由位于p16-exon1上游約15kb最新發現的短片段(exon1β)拼接至p16外顯子2、3上而成，那么就有可能產生兩種轉錄產物：p16αmRNA和p16βmRNA［12］。Duro等［13］研究發現在B淋巴細胞位于9p21染色體p16外顯子1上游的一個片段(0.18kb)的嵌合轉錄模本，它可作為p16選擇拼接轉錄模本的一部分而被轉錄，它與編碼p16蛋白的開放閱讀框架(ORF)不一致，這種情況可能產生兩種蛋白，p16蛋白及另一截斷的p16蛋白(p16β蛋白)，分子量為1.38kD，p16β轉錄模本將能起始翻譯產生一種不同于p16的蛋白，盡管p16β角色有待闡明，日前的研究證實大鼠的p16β在腫瘤抑制作用中扮演重要角色。實驗發現體外轉染p16βcDNA可抑制人或小鼠腫瘤的生長［13］。p16β轉錄模本在鼻咽部過度增生的上皮細胞及發生突變和過甲基化的鼻咽癌組織細胞中表達。Quelle［14］等轉染p16βcDNA到3T3成纖維細胞中而觀察到細胞周期停滯在G0～G1或G2～M期。Liggett［14］同樣通過細胞轉染證實p16β和p16一樣具有生長抑制作用，并這種抑制作用不需要功能性的PRb的存在。鼠的p16β(p19ARF)比推斷的人類p16β蛋白長19個氨基酸，但目前還沒有人類細胞內源性p16βmRNA翻譯產生蛋白的證據。
3p16基因及其產物在腫瘤中的失活機制
p16基因及其產物在人類許多原發性腫瘤和細胞株中發生改變，如腦腫瘤、頭頸癌、肺癌、食管癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等［15］均發現較高的p16基因的失活，主要失活機制有：突變、純合性缺失及5′CPG島甲基化失活等。(1)p16基因的突變包括無義突變、錯義突變和移碼突變。其突變部位主要在外顯子1和外顯子2。雖然大部分腫瘤細胞系中檢測到p16基因突變，但原發性腫瘤組織中除胰腺癌和食管癌及成膠質細胞瘤外，其他腫瘤p16基因突變率很低，SUN等［16］利用SSCP直接測序的方法在42例鼻咽癌和2個鼻咽癌細胞系均未發現p16基因的點突變，LO［17］等也發現在原發性鼻咽癌及鼻咽癌的異種移植物中均未發現p16基因突變。Zhang等只檢測到4/68的原發性頭頸鱗癌和1/9的頭頸鱗癌細胞系中p16基因的點突變，所以點突變并不是p16基因失活的主要方式，且突變只有發生在編碼p16蛋白4個鉤狀重復結構區域內的DNA序列，才導致p
16蛋白失去對cyclinD/CDK的抑制作用，而蛋白羧基末端區對結合與抑制CDK活性并不重要。(2)Melo等［18］通過對一些細胞系和原發性腫瘤p16基因的研究發現p16基因的純合性缺失是p16基因在腫瘤中失活的主要機制，85%的惡性間皮瘤、82%的星形細胞瘤、70%～90%的腦膠質瘤［13，16］、60%～70%的骨肉瘤、50%～60%的乳腺癌、胰腺癌和腎癌，25%～60%的惡性黑素瘤［19］、頭頸部腫瘤［16］和白血病20%～50%的膀胱癌［17］、肺癌［12，16］、卵巢癌和淋巴瘤的細胞系中發生純合性缺失。而在睪丸腫瘤、宮頸癌和結腸癌、神經母細胞癌［12］細胞系中未發現p16基因的純合性缺失。且發現原發性腫瘤組織中p16基因的缺失率低于相應腫瘤細胞系［18］在乳腺癌［20］殖系腫瘤組織［21］未檢測出p16基因的改變。(3)DNA甲基化對于正常胚胎的發育是必需的，但它的異常卻能導致腫瘤的發生。近年來發現腫瘤細胞中出現染色體區域性高甲基化與抑癌基因功能的丟失有關，可能是腫瘤甲基化不平衡中的重要部分，基因啟動子區域5′CPG島甲基化常伴有基因的轉錄失活。CPG島是基因組C、G富集區，細胞中約有40%的基因啟動子區域具有CPG島［22］。正常情況下，除失活的X染色體［23］外，常染色體基因CPG島均處于非甲基化狀態，而在細胞癌變過程中(包括頭頸部腫瘤)常染色體基因CPG島存在廣泛的甲基化p16基因的外顯子1啟動子區域存在一CPG島，在被檢測的正常組織中它處于非甲基狀態。在一些p16等位基因較少發生點突變或純合性缺失的人類腫瘤中，如小細胞肺癌株出現高比例(78%)的5′CPG島甲基化而失去轉錄活性［24］；在乳腺癌(37%)、前列腺癌(60%)、腎癌(23%)細胞株中及原發性的乳腺癌(31%)和結腸癌(40%)也出現同樣現象，特別是結腸癌細胞系中甲基化發生率高達97%，尤其是在一些未發生純合性缺失的結腸癌細胞中，p16基因的兩個等位基因都出現異常甲基化，并與其完全失活是相關的［25］。后來又發現在結腸癌病人的正常結腸黏膜也出現甲基化，這在正常細胞常染色體基因中是罕見的，一般島都是非甲基化的。p16基因的甲基化失活也發生在其他原發性人類腫瘤：包括膀胱癌、肺癌、頭頸部鱗癌［17，26］。由此可見，p16基因通常是通過純合性缺失和5′CPG島甲基化而失去抑制生長的功能。Merlo等［27］還發現，p16甲基化具有一定的基因特異性，在一些腫瘤細胞株中，位于染色體9p21與p16相鄰的p15/MTS2基因CPG島未見甲基化。p16甲基化發生于不同腫瘤的不同時期，p16甲基化發生于頭頸部鱗癌等惡性腫瘤的早期，可能具有早期腫瘤的診斷價值，而在食管癌的中晚期，與食管鱗狀細胞癌的轉移及浸潤有關［28］。所以在進行腫瘤分子篩選時只需測定其產物(如熒光免疫原位雜交、免疫組化)，較之測定基因結構改變更為優越。另一方面，不象突變和缺失等基因改變，甲基化基因改變是可逆的，如去甲基化劑5aZadC處理可誘導頭頸部癌和肺癌細胞株中p16的再表達［27］，并可抑制腫瘤細胞的生長。因此，抑制基因甲基化的研究，對人類腫瘤的防止具有重要的意義。
p16甲基的失活機制與其他抑癌基因不同，不是通過丟失一個等位基因，繼之另一等位基因出現突變而失活，而主要表現為p16基因的純合性缺失和5′CPG島的甲基化。
4小結
p16作為一種抑癌基因，它有比以往所發現的任一種抑癌基因與人類多種腫瘤的發生、發展的關系更為密切、廣泛。其致癌機制更清晰、直接，它的作用對象單一，并且該基因小易于操作，p16可與其他抑癌基因如Rb、p53相互協調，共同抗癌。因此，以p16基因作為目的基因的基因替代治療，以及針對p16基因甲基化失活的治療，將在包括喉癌在內的人類腫瘤的基因治療中具有廣闊的應用前景。
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