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【關鍵詞】戰骨;,,黃毛豆腐柴;,,指紋圖譜;,,高效液相色譜法;,,壯藥
摘要:目的采用高效液相色譜法對壯藥戰骨藥材進行指紋圖譜的研究,為戰骨藥材質量標準的提升提供實驗依據。方法實驗采用PhenomenexGeminiC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),以乙腈-0.05mol/L醋酸水溶液為流動相進行二元梯度洗脫,流速1.0ml/min,柱溫25℃,檢測波長274nm。結果以23個共有峰為評價指標,精密度和重復性實驗中各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%,符合有關規定要求。結論此方法操作簡單,精密度、穩定性和重復性良好,有助于戰骨藥材的質量控制。
關鍵詞:戰骨;黃毛豆腐柴;指紋圖譜;高效液相色譜法;壯藥
Abstract:ObjectiveThefingerprintchromatogramswereestablishedforqualityevaluationoftraditionalZhuangnationalitymedicineZhangu(therootofPremnafulvacraib)byhighperformanceliquidchromatography.MethodsTheanalysiswasperformedonaPhenomenexGeminiC18column(4.6mm×250mm,5μm)withacetonitrile0.05mol/Lethanoicacidasmobilephaseinagradientmodeataflowrateof1.0ml/min,andatacolumntemperatureof25℃.Thedetectionwavelengthwas274nm.ResultsTwentythreepeakswereselectedasthecommonfingerprintpeaks.Therelativestandarddeviationsforrelativeretentionvaluesandrelativepeakareaswerelessthan3%論文網在線
Keywords:Zhangu;PremnafulvaCraib.;Fingerprint;Highperformanceliquidchromatography;TraditionalZhuangNationalitymedicine
壯藥戰骨是馬鞭草科植物黃毛豆腐柴PremnafulvaCraib.的干燥莖,別名土霸王、穿云箭[1]。多分布于廣西百色、南寧地區等地,藥源豐富,價廉易采收,屬可持續利用的天然藥物資源。戰骨具有活血散淤、強筋健骨、驅風止痛的功效,廣西民間常用于治療腰腿痛、跌打損傷、風濕性和類風濕關節炎及感冒身痛、淋巴結炎、肝區疼痛等[2~4]。戰骨中含有多種化學成分,其主要有效成分為柚皮素等黃酮類化合物[5~7]。由于受產地、氣候、生態環境等因素的影響,不同藥材所含有效成分差異較大。針對中藥材的某個有效成分對藥材進行定性、定量并不能有效控制中藥材的質量。指紋圖譜能夠從綜觀和整體上表征中藥材的特征,目前已成為國際上公認的控制天然藥物質量的有效手段[8,9]。本文以提高戰骨藥材質量標準,促進民族醫藥發展為目的,對廣西不同產地戰骨藥材進行了指紋圖譜的研究。
1材料與方法
1.1儀器與藥品儀器:美國PerKinElmer公司Series200高效液相色譜儀(包括Series200紫外檢測器、Series200二元泵、600Series接口及色譜工作站)。PhenomenexGeminiC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)。藥材:戰骨(產地:廣西,經廣西南寧食品藥品檢驗所中藥室鑒定,均為馬鞭草科植物黃毛豆腐柴的干燥莖。來源見表1)。試劑:乙腈、甲醇為色譜純,乙醇、醋酸為分析純,水為高純水,柚皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所)。
表1戰骨藥材樣品來源及批號(略)
1.2色譜條件以乙腈-0.05mol/L醋酸水溶液為流動相進行二元梯度洗脫,流速1.0ml/min,柱溫25℃,檢測波長274nm,進樣量20μl。梯度洗脫程序結果見表2。
表2流動相梯度洗脫程序(略)
1.3方法
1.3.1參照物溶液的制備取柚皮素對照品適量,用甲醇溶解,定容,作為參照物溶液(含柚皮素104μg/ml)。
1.3.2供試品溶液的制備取各批戰骨藥材粉未(過2號篩)約2.5g,精密稱定,置于錐形瓶中,精密加入30%乙醇溶液50ml,超聲處理1.5h,放冷,再稱定重量,用30%乙醇溶液補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。不立即分析的樣品可暫存于4℃的冰箱保存。
1.3.3測定方法分別精密量取參照物溶液和各供試品溶液20μl,注入液相色譜儀,記錄90min色譜圖即得。以柚皮素的色譜峰(S)的保留時間和峰面積為1,計算其它各峰的相對保留時間和相對峰面積比值。
2結果
2.1方法學考察
2.1.1精密度以1#藥材制備供試品溶液,在“1.2”項下色譜條件下,連續進樣5次,檢測指紋圖譜。結果表明,色譜圖中各色譜峰的相對保留時間的RSD小于0.98%;相對峰面積的RSD小于2.31%,符合指紋圖譜要求,表明儀器精密度良好。
2.1.2重復性以1#藥材5份,制備供試品溶液,分別檢測指紋圖譜,結果表明各色譜峰的相對保留時間的RSD小于1.91%;單峰面積大于等于5%總峰面積的色譜峰其相對峰面積的RSD小于2.28%,表明方法的重復性良好。
2.1.3穩定性取1#藥材制備供試品溶液,分別在0,12,17,37,48h檢測指紋圖譜,結果表明,各主要色譜峰的相對保留時間的RSD小于2.51%,相對峰面積比值的RSD小于2.89%,表明供試品溶液在48h內穩定。
2.2指紋圖譜的建立及分析
2.2.1指紋圖譜及共有峰的標定對10個戰骨藥材樣品進行了測定,其色譜圖有23個主要的共有特征峰(占總峰面積的90%以上)。其典型的HPLC-UV指紋圖譜見圖2。其中17號峰為柚皮素(與參照物對照確認,色譜圖見圖1)。10批樣品中,單峰面積與總峰面積的比值大于20%的共有峰只有17號峰,大于10%的共有峰有21號峰,大于5%的共有峰有1號和4號峰。結果表明1,2,3………23號峰在10批樣品的色譜圖中均出現。以柚皮素對照品保留時間為參照,計算各共有特征指紋峰的相對保留時間,相對保留時間的RSD小于2.10%(n=10,結果見表3)。因此標定此23個峰為共有指紋峰,并據此建立戰骨藥材的HPLC指紋圖譜。
表310批戰骨藥材共有指紋峰的相對保留時間(略)
2.2.2共有指紋峰面積與參照物峰面積的比值以柚皮素峰面積為參照,計算各批藥材供試品共有指紋峰的峰面積比值,結果見表4。由表4和圖3可見,各批供試品指紋圖譜的重現性較好,但各批樣品間共有指紋峰的相對峰面積有一定差異。
2.2.3非共有峰面積供試的10批樣品共有指紋峰面積之和占總峰面積比值平均為93.69%,則非共有峰面積占總峰面積的比值平均為6.31%,符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》[10]。
2.3指紋圖譜的檢驗取10批戰骨藥材,按供試品溶液的制備方法操作,分別取各批藥材制成的供試品溶液,按供試品檢測法進行檢測,并與典型的指紋圖譜相比較,結果表明各批樣品指紋圖譜相似度較好,共有23個共有峰,而且各共有峰的相對保留時間的RSD均小于3%。結果見圖3及表3。
3討論
3.1實驗過程中選擇了多種流動相系統:①甲醇-水,②甲醇-醋酸水溶液,③乙腈-水,④乙腈-醋酸水溶液等度和梯度洗脫幾種方式,并對梯度洗脫程序進行優化,結果表明以“1.2”項下系統為最佳。各色譜峰分離度較好,峰型尖銳,保留時間適中。
3.2實驗中對戰骨藥材供試品溶液進行紫外掃描,在274nm和280nm有最大吸收。分別在254,274,280nm和288nm[11]波長下測定指紋圖譜,從色譜圖中的基線、峰型和分離度等因素綜合考慮,選擇274nm為指紋圖譜的檢測波長。
表410批戰骨藥材共有指紋峰的相對峰面積(略)
3.3不同產地的戰骨藥材指紋圖譜相似度較高,23個共有峰相對保留時間符合程度較好,但相對峰面積有一定差異。提示藥材應在固定產地的前提下才能保證藥品的一致性,同時說明以簡單測定一個或幾個成分含量為主的傳統質量控制方法已不能真正反映中藥材質量,而利用指紋圖譜對藥材進行綜合、宏觀地評價是當今對天然藥物質量控制的有效手段。論文網在線
3.4本實驗所建立的方法,精密度、穩定性和重復性符合指紋圖譜研究的技術要求[10],為壯藥戰骨及制劑的質量控制提供了一定的科學依據,對壯藥戰骨藥材質量標準的提升進行了有益的探索。
圖1柚皮素HPLC圖譜(略)
圖2戰骨藥材HPLC指紋圖譜(樣品1#)(略)
圖310批戰骨藥材HPLC指紋圖譜(略)
參考文獻:
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