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【摘要】目的探討蘆薈大黃素苷與dna的相互作用。方法采用電子吸收光譜,熒光發射光譜,粘度實驗以及凝膠電泳實驗進行研究。結果與結論蘆薈大黃素以插入方式與DNA分子結合;較高濃度的蘆薈大黃素苷能夠使Bel7402肝癌細胞DNA由超螺旋構型轉化為缺刻構型。
【關鍵詞】蘆薈大黃素苷;分子識別;凝膠電泳;DNA
Abstract:ThebindingpropertiesofbarbalointoDNAwereinvestigatedbyUVvisibleelectronabsorptionspectrum,fluorescenceemissionspectrum,viscositymeasurementandgelelectrophoresis,andinsertionofbarbalointoDNAwasidentified.HigherconcentrationofbarbaloincouldconvertDNAconfigurationofhepatomacarcinomacellBel7402fromsuperhelixtoindention.
Keywords:barbaloin;molecularrecognition;DNA
蘆薈是一種傳統的常用中藥,用于治療如燒傷、燙傷等疾病并被廣泛應用于食品和化妝品等行業,并被。蘆薈大黃素苷(圖1)是蘆薈塊莖的主要成分,異蘆薈大黃素苷是植物中的主要存在形式,通過非酶催化轉化為蘆薈大黃素苷,因此通常得到的是蘆薈大黃素苷和異蘆薈大黃素苷的混合物[1,2]。蘆薈的抗菌、抗炎、抗氧化作用等與蘆薈大黃素苷的存在密切相關[3,4]。在生物體內蘆薈大黃素苷通過代謝轉化為蘆薈大黃素而發揮藥理作用[5,6]。
圖1蘆薈大黃素苷和異蘆薈大黃素苷的分子結構(略)
Fig.1Themolecularstructureofbarbaloinandisobarbaloin
近年來的研究表明,蘆薈大黃素具有抑制腫瘤細胞生長的作用[7-12]。研究發現蘆薈大黃素能促進人早幼粒HL60白血病細胞P27基因過度表達,并誘導腫瘤細胞凋亡[13]。一般認為DNA是抗腫瘤藥物的靶點之一[14]。藥物分子可以通過共價結合、插入作用、溝結合方式或靜電結合方式與DNA分子締合,對DNA的構象產生微擾,達到抑制腫瘤生長的目的。
本文采用熒光光譜和流體力學方法研究了蘆薈大黃素苷與DNA分子的締合機理。結果表明蘆薈大黃素苷能夠以插入方式與DNA分子結合;凝膠電泳實驗結果表明,光照下蘆薈大黃素苷能夠使Bel7402肝癌細胞DNA的超螺旋構型發生一定程度的轉化。
1實驗部分
1.1儀器與試劑
蘆薈大黃素苷由中山大學化學與化學工程學院陸偉剛博士提供;Bel7402肝癌細胞由中山大學腫瘤研究所提供。所用化學試劑均為分析純,除非另有說明,所有試劑未作任何處理。蘆薈大黃素苷用5mmol/LTrisHCl,50mmol/LNaCl(pH=7.2)緩沖溶液配制。小牛胸腺DNA(華美公司);電泳級瓊脂糖(Promega公司)。MPS2000型紫外可見光譜計(Shimadzu);RF2000型熒光分光光度計(Shimadzu);烏氏粘度計;DYYⅢ4型穩壓穩流電泳儀(北京六一儀器廠)。
1.2實驗方法
1.2.1Bel7402肝癌細胞的提取
按文獻方法[15]進行:收集培養好的Bel7402腫瘤細胞,以磷酸鹽緩沖液洗滌,14000r/min離心5min,收集底部白色固體沉淀,重復3次,加入RNaseA(20mg/mL)50μL和質量分數為10%的SDS20μL,56℃孵育2h,然后加入蛋白酶K(20mg/mL)35μL,37℃孵育24h,加入10mol/LNH4OAc150μL和無水乙醇1.2mL,20℃過夜,得到DNA的溶液,離心、干燥后,將DNA溶解在150μLTrisHCl緩沖溶液中。
1.2.2紫外-可見吸收光譜實驗
在參比池和樣品池中分別加入等量的DNA以消除DNA本身的吸收,當蘆薈大黃素苷的電子吸收光譜不再變化,此時吸收滴定達到飽和。
1.2.3熒光光譜實驗
在樣品池中加入一定體積的蘆薈大黃素苷溶液,每次往池中加入一定體積的DNA,直至熒光光譜不再變化。
1.2.4粘度實驗
在(25±0.1)℃恒溫水浴中使用烏氏粘度計測量。DNA的流出時間用數字秒表測量得到,每個樣品測量3次,取3次測量的平均值,以(η/η0)1/3蘆薈大黃素苷的濃度作圖[16]。
η=t-t0
η:DNA的粘度;t:DNA溶液的流出時間;t0:緩沖溶液的流出時間;η0:沒有加入蘆薈大黃素苷時DNA的粘度。
1.2.5電泳實驗
TBE緩沖溶液中、1%的瓊脂糖凝膠上進行,電泳電壓30V,電泳40min,溴乙錠染色,照相。
2結果與討論
2.1DNA對蘆薈大黃素苷電子吸收光譜的影響
電子吸收光譜是研究小分子化合物與生物大分子相互作用的常用方法之一。室溫下TrisHCl(pH=7.2)緩沖溶液中,蘆薈大黃素苷在300~400nm之間有一個強的ππ*躍遷,其電子吸收峰的最大值為359nm。當向溶液中加入小牛胸腺DNA以后,蘆薈大黃素苷的電子吸收光譜出現明顯減色效應,其電子吸收降低約5%(Δλ=1nm),見圖2。
圖2蘆薈大黃素苷與DNA作用的紫外可見光譜變化圖(略)
Fig.2TheelectronicspectraofbarbaloinintheabsenceandinpresenceofCTDNA
2.2DNA對蘆薈大黃素苷熒光發射光譜的影響
室溫下,TrisHCl緩沖溶液中,當用260nm波長激發,蘆薈大黃素苷在360~440nm之間有一個熒光發射峰,其熒光發射峰的最大位置在372nm。當向溶液中加入小牛胸腺DNA后,蘆薈大黃素苷的熒光發射峰明顯增強,見圖3。這可能是蘆薈大黃素與DNA分子結合后,由于DNA雙螺旋鏈具有疏水性作用,能夠保護蘆薈大黃素分子不受水分子的淬滅作用。
圖3蘆薈大黃素苷與DNA作用的熒光發射光譜變化圖(略)
Fig.3TheemissionspectraofbarbaloininabsenceandinpresenceofCTDNA
2.3蘆薈大黃素苷對DNA粘度的影響
當小分子化合物與DNA分子作用后,由于其作用模式的不同,對DNA的粘度將產生不同的影響。一般來說,當化合物以插入方式與DNA分子作用后,由于化合物分子嵌入到DNA的堿基對中,使DNA雙螺旋鏈拉張,將導致DNA的粘度上升;而以溝面結合方式與DNA作用的化合物,由于使DNA雙螺旋鏈發生不同程度的折疊和扭曲,將使其粘度下降;以靜電作用方式與DNA分子結合的化合物,對其粘度的影響則出現無規律的變化。蘆薈大黃素苷對小牛胸腺DNA的粘度的影響見圖4。從圖中可以看到,當DNA溶液中加入蘆薈大黃素苷后,DNA的粘度明顯增強,表明蘆薈大黃素苷是以插入方式與DNA分子結合。
圖4DNA溶液粘度變化圖(略)
Fig.4TheviscosityofCTDNAinpresenceofbarbaloin.EB(▲);barbaloin(■)
2.4蘆薈大黃素苷對Bel7402肝癌細胞DNA的光裂解作用
一般來說,不同構型DNA在電場中遷移速率不同。具有超螺旋結構的DNA分子由于結構緊密,在電場中遷移速率最快,而缺刻構型的DNA破壞了DNA的雙螺旋結構,在電場中的遷移速率最慢,線性構型DNA分子在電場中遷移的速率居于兩者之間。蘆薈大黃素苷對Bel7402肝癌細胞DNA的影響見圖5。從圖中可見,當體系中未加入蘆薈大黃素苷時(Lane1),Bel7402肝癌細胞DNA主要是以超螺旋構型存在(FormI);當向體系中加入低濃度的蘆薈大黃素(Lane2-4),Bel7402肝癌細胞DNA構型無明顯變化;但是在高濃度蘆薈大黃素作用下(Lane5),Bel7402肝癌細胞DNA構型發生變化,其缺刻構型(FormⅡ)的比例明顯增加,表明蘆薈大黃素以插入方式嵌入到Bel7402肝癌細胞DNA中。
1.DNA2.DNA+蘆薈大黃素(25μmol/L)3.DNA+蘆薈大黃素(50μmol/L)4.DNA+蘆薈大黃素(75μmol/L)5.DNA+蘆薈大黃素(100μmol/L)
圖5磷酸緩沖溶液(pH7.4)中蘆薈大黃素對Bel7402旰癌細胞DNA的光裂解作用(略)
Fig.5ElectrophorogramoflivercancercellsBel7402DNAinabsenceandinpresenceofbarbaloininphosphatebuffer(pH7.4)solutions
3結論
以上研究表明,蘆薈大黃素能夠以插入方式與Bel7402肝癌細胞DNA分子發生契合。契合以后,蘆薈大黃素分子對Bel7402肝癌細胞DNA分子的結構會產生微擾,并使其由超螺旋構型向缺刻構型轉化,這可能是蘆薈大黃素具有抗腫瘤作用的一個原因。
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