基因治療慢病毒
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基因治療有望成為治療遺傳病、腫瘤、病毒感染及其它難治性疾病的有效手段，但目前基因轉移方法的局限性成為實現這一希望的最大障礙。非病毒學的基因轉移方法效率較低；已用于人體試驗的基因治療方案絕大多數是以病毒學方法進行基因轉移的，其中以逆轉錄病毒載體和腺病毒載體最為成熟。常用的逆轉錄病毒載體從小鼠白血病病毒(MLV)改造而來，雖可使目的基因整合至靶細胞基因組、實現穩定表達，但只能轉導分裂細胞，目前主要用于基因治療的離體方案；腺病毒載體既能轉導分裂細胞，亦可轉導靜止細胞，轉導效率也較高，但目的基因不整合至靶細胞基因組，僅能短暫表達，而且腺病毒本身某些抗原的表達可引起人體免疫反應，阻止其重復轉導；其它一些病毒載體如腺相關病毒(AAV)載體、單純皰疹病毒(HSV)載體亦因各種原因不能令人滿意。
理想的病毒載體能同時提供高效的基因轉移、長期穩定的基因表達及生物安全性。近來，一些研究者把目光投向了以Ⅰ型為人免疫缺損病毒(HIV-1)為代表的慢病毒。研究表明［1-5］，以HIV-1為基礎構建的這類慢病毒載體具有可感染非分裂細胞、目的基因整合至靶細胞基因組長期表達、免疫反應小等優點，適于體內基因治療，因此有望成為理想的基因轉移載體。本文即對該類載體的研究進展做一簡介。
1HIV-1基因組的基本結構［6］
HIV-1DNA前病毒的主要結構基因及其排列形式與其它逆轉錄病毒相同，均為5′LTR-gag-pro-pol-env-3′LTR。其中gag基因編碼病毒的核心蛋白，pol基因編碼病毒復制所需的酶類，env基因編碼病毒的包膜糖蛋白，pro基因則編碼切割蛋白前體所需的蛋白酶。與其它逆轉錄病毒不同的是，HIV-1基因組尚有較多調節基因，其中屬于HIV-1基因復制所必需的tat基因和rev基因，分別編碼兩個反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白，前者在HIV-1基因組復制和轉錄延伸過程中發揮重要作用，后者則可促使HIV-1基因的表達由早期向晚期轉化。非HIV-1復制所必需的調節基因有nef、vif、vpr和vpu。這些基因的編碼產物都有各自的功能，有些尚未完全闡明，在此不一一贅述。
2構建HIV-1載體系統的基本原理［7］
HIV-1載體系統由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建，能夠反式提供產生病毒顆粒所必需的蛋白；載體成分則與包裝成分互補，即含有包裝、逆轉錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組恢復成野生型病毒的可能，需盡量減少二者的同源性，如將包裝成分上5′LTR換成巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、3′LTR換成SV40polyA等。包裝成分通常被分開構建到兩個質粒上，一個質粒表達Gag和Pol蛋白，另一個質粒表達Env蛋白，其目的也是降低恢復成野生型病毒的可能。圖1所示為Trono等建立的HIV-1載體系統中的一種［1］。將包裝成分與載體成分的3個質粒共轉染細胞(如人腎293T細胞)，即可在細胞上清中收獲只有一次性感染能力而無復制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。
3HIV-1載體系統的改進
近年來，已有多個實驗室建立了復制缺陷的HIV-1載體系統，用于不同目的的研究，如分析病毒的感染力［8］、篩選抗病毒藥物［9］、評價Env糖蛋白的不同區域在介導病毒進入細胞中的作用［10］等。而目前對于以基因治療為目的的HIV-1載體系統，研究的焦點集中在如何擴大其嗜性范圍、確保其安全性及提供其滴度和轉導能力上。1996年以來，Trono領導的課題組發表了一系列令人鼓舞的研究結果［1～3］，主要包括以下幾方面的改進。
3.1包膜蛋白
最初的HIV-1載體顆粒，均由其本身的包膜蛋白Env所包裹，僅對CD4+的細胞具有親嗜性。1996年，Trono課題組的Naldini等［1］設計的HIV-1載體系統(見圖1)采用表達水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的質粒和雙嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的質粒，分別取代表達HIV本身包膜蛋白Env的質粒，使HIV-1載體顆粒包上了VSV或雙嗜性MLV的包膜。這樣做的結果至少具有三個方面的積極意義：①包膜的更換進一步降低了HIV-1載體恢復成野生型病毒的可能；②使HIV載體感染宿主的范圍不再僅限于CD4+細胞，而擴大到幾乎能感染所有組織來源的細胞；③VSV的包膜賦予HIV載體顆粒高度的穩定性，使其能夠通過超速離心而濃縮，達到高滴度。Naldini等已使HIV-1載體滴度由105轉錄單位(TU)/ml達到108TU/ml。這樣的改進無疑是HIV載體系統走向應用而邁出的一大步。
3.2包裝成分
包裝成分的構建應在不影響重組病毒的裝配和感染力的前提下，盡可能地減少無關的HIV-1蛋白的表達，為野生型病毒的恢復設置障礙。Naldini等［1，2］在構建包裝質粒pCMVΔR9和pCMVΔR8.2時，分別在env基因閱讀框架前插入了多個終止密碼子或刪除了env基因中1.4kp的序列，代之以終止密碼子，以阻止env基因的表達。在此基礎上，Zufferey等［3］將包裝包裝質粒上表達調節蛋白Nef、Vif、Vpr和Vpu的4個基因分別刪除或聯合刪除，結果發現它們對于產生HIV-1載體顆粒是非必需的，即使完全刪除，得到的載體顆粒仍具備轉導非分裂細胞的能力。這4個調節蛋白或已被證實、或被高度懷疑是構成HIV毒性的因素［11，12］，將其刪除、加上包膜蛋白的替換，可使制備HIV載體過程中產生野生型病毒的可能必微乎其微。
3.3載體質粒
載體質粒上HIV-1的順式序列通常包括兩端的LTR、剪切位點及包裝信號Ψ等。此外，研究表明［7］，gag基因5′端的序列可提高載體RNA的包裝效率；Rev蛋白需要與Rev反應元件(RRE)相作用，將未剪切的載體轉錄產物從細胞核轉運到胞漿。因此，Naldini等［1～3］在載體上保留了gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，提高了產生載體顆粒的能力。對于載體上需含有多少順式作用序列為最佳，目前尚不完全靖楚。
4HIV-1載體介導基因轉移的體內外實驗
迄今，Trono課題組構建的HIV-1載體系統已在體外轉導過人子宮頸癌細胞(HeLa)、鼠成纖維細胞(208F)、原代培養的人巨噬細胞、人呼吸道上皮細胞等，結果表明［1-5］，HIV-1載體無論對分裂細胞還是非分裂細胞均能轉導，但對非分裂細胞的轉導效率與細胞所停止的周期有關。HIV-1載體對G0期細胞的轉導效率不如對靜止于G1/S或G2期的效率高，停止于G0期的時間越長，這種差別越大。這可能是由于某些G0期細胞內脫氧核苷酸濃度低、影響了反轉錄步驟，造成報告基因未表達所致的表觀現象。實際上，HIV-1載體有的已進入到G0期的靶細胞內，建立了轉錄中間體。一旦這類細胞進入細胞周期，載體所攜帶的基因就會表達。
在動物體內實驗中，Naldini等［1］將HIV載體注射成年大鼠腦組織，30天后取腦組織，未觀察到病理變化，免疫組化顯示報告基因能夠在終末分化的神經元中表達，證明HIV載體對體內基因轉移是有效的。此后，他們將重組病毒在轉導前用dNTP和多胺處理，以增加病毒內逆轉錄反應，可使對大鼠神經元的轉錄數率提高2倍，報告基因可表達3個月以上［2］。Miyoshi等［4］將攜帶綠色熒光蛋白(GFP)基因的HIV載體注射大鼠眼球，GFP能在感光細胞和視網膜色素細胞中表達，如果以視紫質啟動子控制GFP，則可在感光細胞中特異地高表達。
對于HIV-1載體進入非分裂細胞后的表達是否全部由整合形式產生，目前尚有不同意見。Naldini等［2］將包裝質粒中的整合酶基因突變，如此而產生的HIV載體不能在非分裂細胞中表達，因此認為HIV載體的表達全部由整合形式產生；而Goldman等［5］卻在轉導細胞中測到了HIV載體前病毒的非整合形式，認為不能排除兩種形式同時存在的可能。
在用HIV-1載體已經進行的所有體內外實驗中［1～5］，未出現過有復制力的HIV，說明其安全性是有保證的。
5HIV載體的基因治療中的應用前景
5.1獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的基因治療［7，13］
目前對于AIDS的基因治療方案，基本上是以逆轉錄病毒載體介導的方式，將抗病毒基因體外導入CD4+T淋巴細胞或CD34+的造血祖細胞，再回輸體內。常用的抗病毒基因包括自殺基因、反義RNA、核酶、RNA誘餌的相應DNA序列以及調節蛋白或結構蛋白的突變體基因等。由于這些治療基因不能到達巨噬細胞和多能干細胞，困此難以重建免疫；此外，體外操作費用昂貴，不適于大規模應用。
HIV-1載體的研究為AIDS的基因治療帶來了新的希望，它可能具有以下優勢：第一，利用HIV-1本身包膜蛋白Env包裹的載體顆粒可以將抗病毒基因直接運抵CD4+T淋巴細胞和巨噬細胞，適于直接的體內治療，而包被了VSV包膜的載體顆粒又能感染多能干細胞，有利于免疫重建；第二，患者體內的野生型HIV-1可將攜帶抗病毒基因的載體拯救出來，使載體擴增并擴散到周圍更多的細胞中發揮抗病毒作用；第三，如果將抗病毒基因置于HIV-1本身的長末端重復序列(LTR)控制之下轉導細胞，則只有當HIV-1感染該細胞時，Tat蛋白反式激活LTR中的TAR元件，抗病毒基因才會表達，使基因表達具有了靶向性。
5.2神經系統疾病的基因治療［1，2，14］
Lesch-Nyhan綜合征是一種遺傳性的代謝性腦病，由編碼次黃嘌呤核糖轉移酶(HPRT)的基因缺陷所引起；帕金森氏病是一種退行性腦病，由于產生多巴的神經元退化，導致大腦紋狀體內多巴胺水平降低，臨床上給患者注射左旋多巴可改善癥狀，但長期注射及藥物的副作用令患者難以承受。較為理想的方式是在腦內持續表達酪氨酸羥化酶(TH)，使其催化酪氨酸轉變為為左旋多巴；Alzheimer氏病也是一種多因素引起的退行性腦病，造成大腦皮質和海馬回神經元萎縮，通常采用神經營養因子防止神經元退化。由于HIV-1載體能夠體內轉導神經元并建立長期穩定的表達，因此對于以上疾病的基因治療非常具有吸引力。可以設想，分別將編碼HPRT、TH或神經營養因子的基因通過HIV-1載體介導，體內注射至神經元，有可能對上述疾病產生良好效果。
5.3血液系統疾病的基因治療［15］
造血干細胞一直被認為是對血液系統惡性腫瘤或其它疾病(如地中海貧血、鐮刀性紅細胞貧血、血友病等)進行基因治療的理想靶細胞，但由于缺乏使目的基因在造血干細胞穩定表達的方法，這方面的研究進展不明顯。盡管小鼠逆轉錄病毒載體能夠轉導經細胞因子刺激后進入細胞周期的造血干細胞，但經此處理的干細胞性質可能會發生改變。HIV載體則可通過直接轉導靜止的干細胞避免這類問題。將多藥耐藥(MDR)基因導入造血干細胞，可使其耐受大劑量化療，可能成為治療白血病和其它惡性腫瘤的有效途徑；將正常珠蛋白基因或凝血因子Ⅷ、Ⅸ分別導入造血干細胞，有望對地中海貧血、鐮刀性紅細胞貧血和血友病產生療效。
5.4其它
囊性纖維化(CF)是由于缺損囊性纖維性穿膜傳導調節蛋白(CFTR)而引起的一種人類遺傳病，其特點是粘液腺功能不足，粘液中含有異常糖蛋白，因而粘液的粘度不正常而影響呼吸道上皮和消化道上皮，引起慢性感染，直至死亡［16］。針對CF的基因治療研究已進行了多年，試用過各種載體，效果不甚理想。最近，Goldman等［5］用HIV-1載體進行了嘗試，動物實驗表明，導入CFTR基因后CF缺陷可被糾正。但他們同時也發現，HIV-1載體轉導增殖中的呼吸道上皮細胞效果較好，而對完全分化的上皮細胞則效率很低。目前尚不完全清楚轉導受限的機制，有待進一步研究。
色素性視網膜炎是一種遺傳性的進行性視網膜退變，癥狀包括視野進行性減小、夜盲、視網膜色素沉著等。研究發現，將視桿細胞cGMP磷酸二酯酶γ亞單位基因導入感光細胞有可能糾正視網膜退變，但導入時機以及導入多少感光細胞才能保持視覺功能尚不清楚。由于成熟的視網膜細胞絕大部分為終末分化細胞，因此HIV-1載體為視網膜病變的研究與治療帶來了希望［4］。
6存在問題
盡管HIV-1載體的研究有了很大進展，但距離臨床應用還有很長的路要走。首先，重組病毒的滴度還不夠高，除Naldini等報道的結果外，其余均在101TU/ml～103TU/ml之間，難以達到體內應用的需要；其次，由于HIV復雜的生物學性質，要像目前常用的小鼠逆轉錄病毒載體那樣建立穩定的HIV載體包裝細胞十分困難，已建立的包裝細胞［17，18］均不理想。據報道，Vpr是一種使細胞進入靜止期的強誘導劑［19，20］，也是建立包裝細胞的主要障礙之一。如果確如前文所述，包裝質粒中的vpr基因并非必需、去除后不影響載體的轉導能力，則建立穩定的包裝細胞是大有希望的。
在保證HIV-1載體的安全性上，迄今已做了種種努力，要產生有復制力的HIV，必須在不同的質粒上發生多次非同源重組事件。即使如此，一旦用于人體試驗，仍然不能打消人們對感染有復制力的HIV-1的顧慮。更為謹慎的做法是，以非人類的慢病毒為基礎構建載體，如猴免疫缺損病毒(SIV)、豬和牛免疫缺損病毒(FIV和BIV)、馬傳染性貧血病病毒等，而目前這些工作尚屬空白。
(本文承蒙侯云德院士審閱，特此致謝)
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