β環連蛋白腎癌發生中作用
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摘要：目的：探討β-環連蛋白在腎癌發生發展過程中的作用及其變化機制。方法：采用免疫組織化學、蛋白印跡、反轉錄聚合酶鏈式反應等方法對本院收治的26例腎癌患者手術標本進行了研究。結果：26例患者中有25例癌組織中細胞胞漿內β-環連蛋白表達明顯高于正常組織，而且腫瘤分期越高，癌細胞內β-環連蛋白的表達也越強，pT3和pT4期的腫瘤內的表達明顯高于pT1和pT2期的腫瘤，P＜0.01，但β-環連蛋白mRNA的表達水平并無明顯變化。結論：細胞內β-環連蛋白表達的增加與腎癌的發生發展有關，可能是腎癌形成和發展的重要機制之一。
關鍵詞：腎腫瘤癌β-環連蛋白
β-環連蛋白（β-catenin）作為細胞內的一種蛋白質，即是Wnt信號傳導途徑中的重要成分，又與細胞間黏附作用有關，這兩種作用都與腫瘤的發生和發展密切相關。目前，在大腸癌、肺癌等腫瘤的研究中已經發現癌細胞胞漿內β－環連蛋白表達增加，但其在腎癌中的表達情況尚未見報道。為了探討β－環連蛋白與腎癌發生、發展的關系，我們采用免疫組織化學、蛋白印跡（westernblot）及反轉錄聚合酶鏈式反應（RT－PCR）方法對26例腎癌患者進行了研究。
資料與方法
隨機選擇1996～1997年間本院腎癌手術標本26例，病理證實為腎細胞癌，其中男性20例，女性6例，年齡19～77歲，平均59.3歲。透明細胞癌18例，顆粒細胞癌4例，混合細胞癌4例。按臨床分期：T1期7例，T2期13例，T3期5例，T4期1例。每份標本為2份，癌組織1份，相應的正常腎組織1份，經10％福爾馬林固定，石蠟包埋，癌組織切片2～3張，正常腎組織切片2張，分別做病理檢查和免疫組化檢驗。留取部分新鮮標本于液氮內用于提取胞漿蛋白和mRNA。
1．免疫組織化學方法：β-catenin單克隆抗體購自美國Santacruz公司，免疫組化采用鏈菌素抗生物素蛋白-生物素酶標法（LSAB），其主要操作步驟：（1）石蠟切片脫蠟入水；（2）3％過氧化氫酸甲醇室溫下孵育30min，封閉過氧化物酶；（3）枸櫞酸鹽緩沖液（0.01mol,pH6.0）中92～98℃10min修復抗原；（4）加2％牛血清白蛋白（BSA）約50μl室溫下孵育30min以阻斷非特異性抗原的反應；（5）加β-環連蛋白抗體（1∶100）約50μl于濕盒內4℃過夜;（6）加生物素標記的二抗（1∶300）約50μl室溫下孵育60min;（7）加鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化酶液（1∶500）50μl，室溫下孵育60min;（8）DAB顯色，蘇木素復染及中性樹脂封片，各步之間用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗5min，3次。陰性對照用PBS替代一抗，其它相同。結果分析采用半定量方法，以胞漿內出現棕黃色為陽性細胞，切片內陽性細胞數大于20%計為陽性，小于20%計為陰性，陽性結果又根據染色深淺分為陽性（＋）和強陽性（＋＋）。正常腎組織和癌組織以及腫瘤不同分期之間的染色結果比較采用直接概率法檢驗和卡方檢驗。
2．Westernblot:應用單去污劑裂解緩沖液從組織中提取胞漿內蛋白質，加等量蛋白提取物于10％聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）中電泳，用電轉儀將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，加1%～3%BSA封閉非特異性結合位點，再加β-環連蛋白抗體和辣根過氧化物酶標記的鏈親和素。最后應用化學發光試劑盒進行化學發光，利用Molecularanalyst圖象分析軟件分析條帶灰度值，用平均值±標準差表示，組間差別用t檢驗。
3．RT-PCR：應用異硫氰酸胍一步法［1］提取組織mRNA，AMV逆轉錄試劑盒和TaqmDNA聚合酶購自promega公司。Thermalcycler1型PCR儀，美國PE公司。IBM586計算機控制的Geldoc1000成像系統，美國Bio-Rad公司。步驟：（1）逆轉錄：25μl反應體系中加入等量的變性后的RNA（3μg）及OligodT0.1μl、AMV0.5μl（20U/μl）、5×Buffer10μl、RNsin100u及無RNA酶的水，混勻、離心5s，42℃孵育1h，95℃5至7min使逆轉錄酶失活后立即置冰浴，待用或－20℃保存。（2）PCR反應：參照文獻［2］設計β-catenin引物，上游引物為：5′GCTaCTTGTGAGTGAAG3′，下游引物為：5′ATGGAACCAGACAGAAAAGC3′，共200bp。以β-actin為對照，上游引物為：5′CTGTCTGGCGGCACCACCAT3′，下游引物為：5′GCAaCTAAGTCATAGTCCGC3′，共254bp。引物由北京生物制品研究所合成，反應體系為10×Buffer5μl、25mmolMgCI24μl、dNTP1μl（各10mmol/μl）、Taq酶0.3μl（5U/μl）、逆轉錄的cDNA為模板2μl、上下游引物各0.5μl（50pmmol/μl）、加水至50μl。混勻、加入50μl石蠟油覆蓋液面，離心10s。將反應管置于PCR儀內，先95℃7min變性，再接95℃變性1min30s、54℃復性1min、72℃延伸1min30s，共35個循環后接72℃延伸10min。反應終止后置－20℃保存。(3)PCR產物定量：PCR擴增結束后，β-catenin和β-actin各取10μl樣品于1.5％瓊脂糖凝膠中電泳60min，電壓為5～7V/cm，每毫升凝膠內含0.5μg的溴化已啶（EB），用電腦照膠儀分析各條帶的灰度值，比較腫瘤與正常組織樣品的β-環連蛋白與β-actin的比值，應用秩和檢驗方法對兩組數據進行分析。
結果
1．免疫組織化學：26例腎癌患者癌組織細胞漿內β-環連蛋白染色強陽性者9例，陽性16例，陰性1例，相應正常腎組織中陽性2例，其余均為陰性。β-環連蛋白在腎癌細胞內的表達主要集中在胞漿內,核內也有染色，腫瘤間質未見陽性染色。β-環連蛋白在腎癌中的表達較正常腎組織中的表達明顯增加，差異有顯著性意義（χ2=21.74，P＜0.01）。
在癌組織中的表達與病理類型及年齡無關，與臨床分期有關，20例pT1和pT2期的腫瘤中強陽性者4例，陽性者15例，陰性1例；6例pT3和pT4期的腫瘤中5例為強陽性，1例陽性。臨床分期為pT3、pT4期的腫瘤較pT1、pT2期腫瘤β-環連蛋白的表達明顯增加（P＜0.01）。
2．Westernblot:β-環連蛋白在腎癌癌細胞漿內的表達比其在正常腎組織細胞內的表達量明顯增加（P＜0.01）。
3．RT-PCR：以每例標本癌組織和正常腎組織中β-環連蛋白與β-actin灰度值的比值，經秩和檢驗兩組數據比較，差異無統計學意義（P＞0.05）,說明癌組織中β-環連蛋白基因的表達并無增加
討論
β-環連蛋白在細胞內具有兩種功能［3］：其一是參與細胞間黏附作用；其二是Wnt信號傳導過程中的重要成分，這兩種作用均與腫瘤的發生發展有關，特別是在Wnt信號傳導中的作用，近年來不斷受到人們的關注。正常組織中細胞內由于結腸腺性息肉基因（APC）、哺乳動物糖元合成激酶3(GSK3β)等的作用，游離的β-環連蛋白很快即被降解，一般不會出現聚集。在癌組織中由于多種原因使癌細胞胞漿內β-環連蛋白增加、聚集，與轉錄因子TCF/LEF形成復合物、進入細胞核內，與DNA結合，促進靶基因的持續轉錄。靶基因的持續轉錄與細胞的增殖與轉化密切相關。有報告3個大腸癌細胞系中均有β-環連蛋白表達的增強，認為大腸癌癌細胞的增殖與轉化與β-環連蛋白靶基因的持續轉錄關系密切，β-環連蛋白的靶基因可能就是大腸癌的癌基因［4］。Xingpei等［5］報告了65例大腸癌患者細胞核內有β-環連蛋白的高表達，且與腫瘤的分期分級有關。在對6例進行性纖維瘤的研究中也發現細胞胞漿內有β-環連蛋白表達的增加［6］。本實驗的結果從定性和定量兩個方面都證明在腎癌癌細胞胞漿內有β-環連蛋白的高表達，提示在腎癌的發生發展過程中有β-環連蛋白的參與，而且其高表達的程度與腫瘤的分期分級有關。腫瘤的分期越高其表達量相對也高，說明由β-環連蛋白引起的靶基因的持續轉錄與腎癌癌細胞的增殖與發展也密切相關。
關于癌細胞胞漿內β-環連蛋白表達增加的原因，目前的看法主要是其降解減緩，而非生成增加。有研究顯示發現盡管腫瘤細胞內β-環連蛋白的表達量增加，而其mRNA水平并無變化［6，7］，本實驗的結果與上述結果一致，再一次證實β-環連蛋白基因在腫瘤中的表達無明顯增加，β-環連蛋白的高表達并非其本身合成增加所致。影響β-環連蛋白降解的因素有Wnt信號的增強，APC的突變以及β-環連蛋白本身的突變等。在對大腸癌的研究中發現β-環連蛋白的高表達主要與APC的突變有關，突變后APC不能降解β－環連蛋白。在Rubinfeld等［8］對黑色素瘤細胞系的研究中發現β-環連蛋白的增加主要與其本身的突變有關，β-環連蛋白突變后可增加其穩定性，使其不被降解。Wnt信號的增強可以抑制APC對β-環連蛋白的降解作用［9］。β-環連蛋白在腎癌癌細胞胞漿內高表達的原因目前研究尚少。至于β-環連蛋白本身的突變尚有待進一步研究。
總之，β-環連蛋白作為Wnt信號傳導過程中的重要成分，在腎癌的發生發展過程中一定有其重要的作用，相信進一步的研究對揭示腎癌的發病機制及指導臨床治療有重要的意義。
參考文獻
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