探究蝗蟲基因的克隆與表達

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1fem-1基因在不同組織中的表達模式解剖

羽化后1d成蟲的8個不同組織部位，包括頭、中腸、卵巢、精巢、脂肪體、體壁、早期胚胎、中期胚胎和晚期胚胎。除精巢、卵巢和胚胎外，其余樣品均為雌、雄蟲相應組織的混合樣品。雌雄蟲各3頭為1個生物學重復，各組織設3個重復，存于液氮中備用。用Trizol試劑提取總RNA，DNaseI(RNaseFree)酶解殘存的DNA，RNA電泳與定量檢測后，參照說明書以2μg的總RNA為模板進行cDNA的合成。根據fem-1基因的cDNA序列設計熒光定量PCR引物，以armadillo基因為內參，引物見表1。采用SYBRPremixExTaqTM染料，使用Eppendorf的MastercyclerePrealplex4熒光定量PCR儀進行定量分析。PCR擴增反應總體積為20μL，包括2正反向引物各0．4μL，模板cDNA0．8μL，超純水8．4μL。擴增程序為:94℃預變性2min;94℃15s，60℃15s，72℃20s，40個循環(huán)。重復3次，使用2－ΔΔCT法計算fem-1基因在不同組織的表達情況。

2fem-1基因在精巢發(fā)育過程中的表達模式

取5齡雄若蟲、羽化后3，6，12和24d的雄成蟲各5頭，解剖出精巢。若蟲為5齡不同時間的混合樣品。總RNA的提取、cDNA制備和定量PCR方法同1．4節(jié)。數據統(tǒng)計與分析采用SPSS13．0軟件對數據進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計數據以平均數±標準差表示。組間差異采用單因素方差(onewayANOVA)分析，兩組比較采用Studentt-test進行分析。P＜0．05代表差異顯著，P＜0．01代表差異極顯著。

3結果

以fem-1為關鍵詞搜索胚胎時期的轉錄組數據庫(未發(fā)表)的注釋信息，得到，長度分別為2625，2142和2233bp，各有一個完整的開放閱讀框。根據Unigenes設計特異性引物，分別擴增3個Unigenes的開放閱讀框，測序后獲得的序列與轉錄組數據庫中鑒定出的Unigenes的相應序列完全一致。在NCBI上在線比對后發(fā)現，這3個Unigenes編碼的氨基酸序列與其他物種的Fem-1具有較高的同源性，且具有特征性的錨蛋白重復序列模體，說明這3個Unigenes是的fem-1基因。根據同源性將這3個基因分別命名為Lmfem-1a，Lmfem-1b和Lmfem-1c，將序列登錄到GenBank，登錄號分別為和基因的序列分析Lmfem-1a，Lmfem-1b和Lmfem-1c基因的序列特點。BLAST分析發(fā)現Lmfem-1a，Lmfem-1b和Lmfem-1c之間的同源性較低，Lmfem-1a與Lmfem-1b，Lmfem-1a與Lmfem-1c以及Lmfem-1b與之間的氨基酸序列一致性分別為25．55%，32．20%和35．40%，但與其他物種相應基因的同源性較高。例如，Lmfem-1a與麗蠅蛹集金小蜂Fem-1(GenBank登錄號:XP_001606383)的氨基酸序列一致性最高，達66．21%，與人體虱和赤擬谷盜Fem-1(GenBank登錄號:XP_967114)的氨基酸序列一致性分別為65．12%和58．47%;Lmfem-1b與赤擬谷盜Fem-1b(XP_975561)的氨基酸序列一致性最高，為70．10%，與人Fem-1b(GenBank登錄號:NM_015322)的氨基酸序列一致性為53．43%;Lmfem-1c與赤擬谷盜Fem-1(GenBank登錄號:XM_001811644)的氨基酸序列一致性最高，為63．96%，與人Fem-1c(GenBank登錄號:NM_020177)的氨基酸序列一致性為53．21%。Lmfem-1a，Lmfem-1b和Lmfem-1c與線蟲Fem-1的氨基酸序列一致性分別為25．04%，26．91%和34．74%將Fem-1與分屬于雙翅目、半翅目、膜翅目、鞘翅目、鱗翅目等昆蟲以及人、鼠等脊椎動物的Fem-1蛋白序列進行比對，并用NJ法繪制了分子系統(tǒng)發(fā)育樹，利用自舉分析(Bootstrap，1000次重復)檢驗各分支的置信度。由進化樹可以發(fā)現:Lmfem-1a，Lmfem-1b和Lmfem-1c分別與其他物種的Fem-1a，Fem-1b和Fem-1c聚到一起，形成明顯的三支。Lmfem-1a與人體虱Fem-1(GenBank登錄號:XP_002426405)的親緣關系最近，Lmfem-1b與麗蠅蛹集金小蜂Fem-1b(GenBank登錄號:NP_001153369)和赤擬谷盜Fem-1b(GenBank登錄號:XP_975561)的親緣關系最近，Lmfem-1c與赤擬谷盜Fem-1(GenBank登錄號:XM_001811644)的親緣關系最近，與同源性比對結果一致。ScanProsite功能序列分析結果表明，Lmfem-1a有6個錨蛋白重復序列模體，而Lmfem-1b和Lmfem-1c分別有8個錨蛋白重復序列模體。Lmfem-1a，Lmfem-1b和Lmfem-1c均無信號肽序列，也無跨膜結構域，屬于細胞內在蛋白質。

作者：時紅郝友進陳斌司鳳玲王鵬何正波單位：重慶師范大學