探究病毒的克隆技術(shù)

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1材料與方法

基因DNA模板、PCMV陽性血清、表達載體pET32a（＋）均由四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術(shù)中心提供，2月齡健康雄性白兔（體重2kg）購自雅安市某家兔養(yǎng)殖基地。克隆載體pMD19－TSimple，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶、IPTG、蛋白質(zhì)Marker購自大連寶生物工程有限公司；、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、購自北京天根生化科技有限公司；N，N’－亞甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、SDS、TEMED、考馬斯亮藍R－250、2－巰基乙醇、溴酚藍、瓊脂糖、甘油、氨芐青霉素、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、硫酸銨等均購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司，其他化學試劑均為分析純。引物的設計與合成應用．0b等分子生物信息軟件對PCMVgB基因及其編碼氨基酸序列進行生物信息學分析，并選擇gB基因2305～2574bp優(yōu)勢抗原表位區(qū)作為目的序列，參照NCBI上的豬巨細胞病毒gB基因序列（登錄號：FJ844360．1），應用Oligo7．0軟件設計引物P1、P2，在引物P1、P2的5′端分別引入酶切位點EcoRⅠ和HindⅢ，用于PCR產(chǎn)物與表達載體的連接，并在引物P1、P2酶切位點后分別引入起始密碼子ATG和終止密碼子TAG。P1／P2擴增的目的片段長270bp，上述引物送上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如下（下劃線處為EcoRⅠ酶切位點），下劃線處為HindⅢ酶切位點）。PCMVgB基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)的PCR擴增以gB基因DNA為模板，分別以P1、P2為上游引物和下游引物，對PCMVgB基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)進行體外擴增。PCR反應的程序為：94℃預變性，經(jīng)30個循環(huán)后，于72℃延伸8min。基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)表達載體的建立及重組蛋白的表達與純化將PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳后，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收目的片段，將目的片段連入pMD19－TSimple克隆載體并轉(zhuǎn)化入E．coliDH5α后抽提質(zhì)粒，進行質(zhì)粒基因組測序，并使用EcoRⅠ和HindⅢ進行酶切，將酶切后的目的片段連接入pET32a（＋）載體，并命名重組質(zhì)粒為pET32a（＋）－gB，轉(zhuǎn)化入E．后將重組表達菌命名為E．。使用濃度為0．2mg／L的IPTG誘導E．重組表達菌表達后，將表達產(chǎn)物通過組氨酸標簽融合蛋白純化柱進行純化，并測定純化后的蛋白質(zhì)濃度。PCMVgB基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白的反應原性分析以純化的PCMVgB基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白作為抗原，PCMV陽性血清為一抗，以HRP標記的羊抗豬IgG為二抗進行試驗，并設置PCMV陰性血清對照組，鑒定PCMVgB基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白的反應原性。多克隆抗體的制備及抗體效價的測定使用純化后的PCMVgB基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白與弗氏佐劑按1∶1體積比進行乳化后制成油乳劑，對健康家兔進行免疫，第4次免疫完成后對試驗家兔采取心血，將血液收集至離心管中，先于常溫傾斜放置30min，再轉(zhuǎn)至37℃培養(yǎng)箱中放置1h，最后轉(zhuǎn)入4℃冰箱中放置過夜，于4000r／min離心15min分離血清。將分離的血清無菌進行分裝后于－20℃保存?zhèn)溆茫⒈苊夥磸蛢鋈凇Ｒ约兓蟮腜CMVgB優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白（質(zhì)量濃度為0．62μg／mL）作為抗原，以瓊脂擴散試驗驗證經(jīng)PBS緩沖液稀釋后的多克隆抗體效價。鑒定以純化的PCMVgB優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白作為抗原，制備的多克隆抗體作為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗進行Western－blot鑒定，以免疫前的家兔血清作為陰性對照，鑒定該多克隆抗體的反應性。

2討論

自1950年P(guān)CMV在英國被發(fā)現(xiàn)以來，該病毒就因為其免疫抑制特性以及能夠通過跨物種器官移植而感染人與其他動物而備受關(guān)注，但由于該病毒分離困難，導致了對該病毒的研究一直落后于其他皰疹病毒科病毒。囊膜糖蛋白B（gB）是PCMV重要的跨膜糖蛋白，也是特定細胞毒T淋巴細胞的主要靶蛋白，是淋巴因子激活的自然殺傷細胞的識別對象，且gB蛋白具有良好的免疫原性，并在誘導機體體液免疫和細胞免疫中起著重要作用，對該蛋白進行研究有助于了解PCMV的感染機制，為該病毒感染的防治奠定了基礎。本試驗構(gòu)建了pET32a（＋）－gB高效重組表達質(zhì)粒，應用原核表達系統(tǒng)以可溶性形式高效表達了PCMVgB優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白，成功表達并純化了PCMVgB優(yōu)勢抗原表位區(qū)重組蛋白，并驗證了其具有良好的反應原性，可以作為間接ELISA檢測的包被抗原，通過瓊脂擴散試驗和Western－blot試驗，也證實了制備的多克隆抗體可以與gB蛋白特異性結(jié)合。本研究為進一步分析PCMVgB蛋白的生物學特性，建立PCMV抗體血清學診斷方法奠定了重要基礎，為制備早期檢測PCMV抗體的檢測試劑盒奠定了基礎。

作者：江一帆劉驍單位：四川農(nóng)業(yè)大學