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本文作者:程春松1,2彭代銀1黃和平1郭友平1作者單位:1安徽中醫學院藥學院2中國中醫科學院中藥研究所
基本檢測技術的應用
現代生物檢測技術在藥用植物的基源鑒定研究、轉基因育種等各方面都有著廣泛的應用,在菘藍的育種研究PCR及RT-PCR技術、SouthernBlot分析、RAPD技術在外源基因檢測、抗性基因的檢測中取得了良好的效果。
1PCR及RT-PCR技術:1985年,KaryMul-lis發明了PCR技術,引用到藥用植物育種研究中,可以通過分離植物基因來鑒定中藥中的目的基因以及DNA指紋圖譜研究。許鐵峰等[11]為了驗證外源基因是否轉入植物細胞內,對抗生素抗性植株進行了PCR檢測,對轉基因菘藍利用農桿菌介導外源半夏凝集素基因進行RT-PCR分析,由于PCR只能證明在轉基因植株體內存在外源目的基因片段,而不能完全確定外源目的基因片段已整合進植物基因組,且PCR可能存在假陽性結果,因此通常配合采用SouthernBlot分析驗證。
2RAPD與擴增片斷長度多態性技術:1990年代提出RAPD技術,該技術現已廣泛地應用于生物的品種鑒定、系譜分析及進化關系的研究[16]。陳桂平等[12]選取同一個無性系植株及其親本進行RAPD分析,得出結果無性系植株的遺傳背景一致性很好,但也發生了DNA水平的變異。這項工作為進一步分離抗性基因和培育抗病品種打下基礎。相對于RAPD技術,AFLP技術與之相類似,它是一項新的分子標記技術,能檢測10倍的軌跡,并且可以檢測任何DNA。
染色體研究技術的應用
藥用植物染色體研究是分子生物學的基礎研究,主要是包括總DNA的提取、染色體制片技術、核型研究以及其結構分析。
1菘藍總DNA的提取:核酸樣品質量將直接關系到實驗的成敗,所得的DNA應達到滿足試驗要求的量和純度。陳桂平等[12]運用的菘藍總DNA提取方法是采用改良的十二烷基磺酸鈉微量提取法提取DNA。丁如賢等[10]采用改良十六烷基三甲基溴化胺法提取總DNA。CTAB是陽離子去污劑,可以很好地去除多糖,因此對于植物DNA的提取具有較高的廣譜性,而SDS是陰離子去污劑,對多糖含量高的植物樣品效果比較差。
2染色體制片技術:菘藍染色體很小,因此,在測量長臂和短臂時,難以確定長、短臂的分界線,只有制作染色體分散、染色體分開,而著絲粒未分開的染色體標本,并把染色體相片盡量放大,才能較準確地確定著絲點的位置,使數據可靠[17]。楊飛等[18]在大麥、玉米染色體研究中多采用去壁低滲火焰干燥壓片法,該方法簡單易行,適合植物染色體制片。
3核型研究:核型是指染色體組在有絲分裂中期的表型,是染色體數目、大小、形態特征的總和。核型研究就是在對染色體進行測量計算的基礎上,進行分組、排隊、配對,并進行形態分析的過程。楊飛等的報道[18]表明:菘藍的核型公式為2n=2x=14=10m(2SAT)+4sm,菘藍核型的對稱等級為2A,是一種比較對稱的核型。鹿萍[17]報道二倍體染色體數為14條,核型公式為2n=2x=14=14m,四倍體染色體數為28條,核型公式為4n=4x=28=28m。以上研究基本確定了菘藍染色體的數目、大小及形態特征。
4染色體分析:隨著分子細胞遺傳學技術的進步,熒光原位雜交技術被廣泛應用于染色體識別和分析[19]。45SrDNA和5SrDNA是編碼核糖體rRNA的基因,參與構建核糖體,已被作為十字花科核型進化分析及比較基因組學研究的重要細胞學標記[20]。楊飛等[18]為了深入研究菘藍的分子細胞學特征,以45SrDNA、5SrDNA和端粒序列為探針,對菘藍有絲分裂中期染色體進行熒光原位雜交實驗,建立菘藍熒光染色體核型。為菘藍分子細胞遺傳圖譜的構建提供了必要依據。
組織培養技術
組織培養技術是藥用植物育種過程中一項基本技術。客紹英等[21]以菘藍幼葉為外植體,對其誘導培養過程中細胞啟動、脫分化、組織分化和器官(芽和根)發生,進行了石蠟切片觀察和分析。李連華等[22]以菘藍愈傷組織為試驗材料,分析比較了不同培養基對菘藍愈傷組織增殖和分化的影響。此外張勝珍等[23]用纖維素酶和離析酶的混合酶液提取菘藍無菌苗幼葉原生質體,他們探索了菘藍原生質體分離和純化的條件,為菘藍的細胞工程育種做出了有效的探索。