肝臟組織工程脫細胞技術論文

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一、脫細胞支架制備方法

全器官脫細胞支架的制備是肝臟組織工程的基礎，通過利用物理、化學或酶解等方法去除細胞成分和遺傳物質，獲得與原有器官相似的超微立體結構和大部分細胞外基質（ECM）成分，保留了完整的支架。1997年Cao等首次制造了人工耳，近年來脫細胞支架已運用于心、肺和腎等器官的組織工程研究，結果表明，脫細胞方案的選擇與支架結構及ECM成分密切相關，具有器官／組織特異性。目前，應用于脫細胞支架制備的方法有很多，每種方法各有優(yōu)勢，其選擇取決于組織的細胞結構、密度、脂肪含量和厚度。為方便科技工作者選擇，對常用的脫細胞因子作如下簡介。

1．化學因子（1）酸和堿：酸能水解生物大分子或催化其水解。過氧乙酸是一種常見的抗感染因子，對殘留的核酸具有很強的去除作用，而對ECM的影響較?。灰宜釙茐哪z原成分，降低ECM的強度，而對硫酸鹽黏多糖的影響較小。堿因其完全去除了ECM中的生長因子，嚴重影響其機械性能，基本只用于早期處理表皮的脫毛。

（2）低滲和高滲溶液：高滲溶液可以分離DNA和蛋白質，低滲溶液可以溶解細胞。為發(fā)揮最大作用，經常將低滲和高滲溶液交替使用，但此法耗時長，處理后的組織易水腫，且不能完全溶解掉細胞殘余物，還需進一步處理。

（3）洗滌劑：分為離子型、非離子型和兩性離子型洗滌劑。通過溶解細胞膜并將DNA從蛋白質中分離，脫細胞效果明顯，然而這些洗滌劑會將ECM中的蛋白質成分去除，蛋白質的丟失程度隨著洗滌時間的增加而增加。多種洗滌劑同時使用會增加ECM蛋白的丟失，優(yōu)點是有利于脫細胞之后洗滌劑的去除。與酶相比，非離子型洗滌劑TritonX－100能夠更有效的從致密組織中去除細胞成分。離子型洗滌劑十二烷基磺酸鈉（SDS）相比于TritonX－100能更好的從致密的組織或器官中去除細胞核成分，同時保持其機械性能；在完全去除細胞核成分中起至關重要的作用，但是會引起一些超微結構的破壞和生長因子的丟失。兩性離子型洗滌劑3－［（3－膽固醇氨丙基）二甲基氨基］－1－丙磺酸（CHAPS）對薄的組織（比如肺）作用較強，但是對于較厚的組織，即使與SDS聯(lián)合使用，脫細胞效果仍然很弱。需要注意的是，脫細胞之后必須將ECM中殘余的洗滌劑去除，特別是SDS，它能夠穿透入較厚和致密的組織，即使在較低濃度時仍對再種植的細胞顯示毒性。

（4）醇類：甘油通過脫水和溶解細胞發(fā)揮作用；甲醇和乙醇能使蛋白質沉淀，進而破壞ECM的超微結構。

2．生物因子（1）酶：能夠用于脫細胞的酶包括核酸酶、胰蛋白酶、膠原酶、脂肪酶、中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和α－半乳糖苷酶，去除細胞成分方面有較高的特異性。然而，用單一的酶來完全去除細胞成分難以達到預期的目的，且殘留的酶不利于細胞再種植，并且存在誘發(fā)不利免疫應答的可能。核酸酶可以裂解核酸序列，可用于去除殘余的核苷酸。胰蛋白酶是一種常用的脫細胞因子，然而，ECM中的蛋白質如膠原蛋白對胰蛋白酶的抵抗能力較弱，因此使用時應格外小心。與洗滌劑相比，胰蛋白酶對彈性蛋白和膠原蛋白破壞力較大，脫細胞速度較慢，但能更好的保護糖胺聚糖。胰蛋白酶脫細胞效果及對ECM的影響程度與時間相關，單獨使用胰蛋白酶完整脫細胞需要很長的時間。值得注意的是，胰蛋白酶可以破壞組織的超微結構，有利于后續(xù)的脫細胞因子的滲透，因此在初始階段使用胰蛋白酶可以起到較好的作用，特別是要從一些致密的組織中完全去除細胞核。脂肪酶有協(xié)助去脂作用。中性蛋白酶的脫細胞效果較好，但會伴隨著ECM更大程度的破壞。（2）非酶因子：螯合物如乙二胺四乙酸（EDTA）和乙二醇雙（2－氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）有助于細胞從ECM蛋白中分離，但是，單獨使用螯合物即使通過振蕩也難以將表層細胞脫去。因此，它們經常和酶（如胰蛋白酶）或者洗滌劑聯(lián)合使用。聯(lián)合使用螯合物與高／低滲溶液脫細胞的效果尚不明確。3．物理和其他因子（1）溫度：凍融技術能有效的溶解組織和器官中的細胞，對組織的超微結構僅有輕微影響。單次凍融可以減少不利的免疫應答，如白細胞浸潤；應用多次循環(huán)凍融對ECM蛋白的含量影響較小。（2）機械振蕩法和壓力：機械振蕩法可通過振蕩產生的能量破壞細胞，多與其他方法聯(lián)合使用，可將細胞從基底膜分離，然而不可避免的造成超微結構和基底膜完整性的破壞。靜水壓力所需時間較短，在血管或者角膜組織脫細胞時的效果比洗滌劑或者酶更有效，但是冰晶的形成會影響ECM的超微結構。（3）非熱力學打孔技術：使用微秒的電脈沖流經組織或者組織中的剩余細胞，可以誘導產生細胞膜表面的微空隙，從而破壞細胞內微環(huán)境，繼而導致細胞死亡。由于非熱力學打孔技術的探針較小，能用它來脫細胞的組織較小，應用明顯受限。

二、脫細胞支架的滅菌

脫細胞支架制備成功后將進行系列體內外實驗，在此之前對支架的滅菌十分重要，常使用去除熱原法來清除殘余的內毒素、病毒和細菌DNA。生物支架可以置于酸或者其他溶劑中以達到滅菌的目的，但是該方法滲透能力不強，且會損傷重要的ECM成分；環(huán)氧乙烷對ECM的機械性能影響較大，并引起不利的免疫應答，進而影響移植后正常功能的發(fā)揮；γ射線、電子束輻射等滅菌方法會改變ECM的超微結構和機械性能；超臨界二氧化碳對ECM和支架的機械性能的影響較其他方法小，目前成為一種替代方法。

三、肝臟脫細胞支架的制備方法

脫細胞器官優(yōu)良的性能為其成功應用于肝臟帶來希望。Shupe等首次報道了嚙齒類動物肝臟的脫細胞，通過下腔靜脈置管，門靜脈切斷，上腔靜脈結扎，PBS去除血管內剩余血液，依次用濃度為1％、2％、3％的TritonX－100各300ml以5ml／min的速度灌注肝臟，以含0．1％SDS的PBS液300ml沖洗。脫細胞肝臟經HE染色，顯示完整的ECM網狀結構；免疫組化染色表明Ⅳ型膠原和層黏連蛋白均保留，且膠原存在于基質中，而層黏連蛋白存在于血管的基底膜中。將106個大鼠肝臟前體細胞WB344置于RPMI1640培養(yǎng)基中，通過置管的下腔靜脈注入肝臟進行再種植，構建出組織工程肝臟。另有文獻報道，經門靜脈插管以1ml／min灌注梯度濃度的SDS（0．01％、0．1％、1％）各24h，用蒸餾水灌注15min、1％的TritonX－100灌注30min清除剩余的SDS。PBS沖洗1h后，從門靜脈注入染色劑可以清楚地觀察到完整的血管結構。將其中一葉置于0．1％的過氧乙酸中滅菌。組織學分析顯示，在支架中幾乎無細胞核結構；免疫組化分析Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、纖連蛋白、β1層黏連蛋白，結果表明其在ECM的結構和血管基底膜的完整性方面與正常肝臟相當，DNA含量分析證實支架中DNA低于3％。大鼠來源的肝細胞經門靜脈以15ml／min灌入，3D動態(tài)培養(yǎng)2周，分別于種植后4h、1、2、5d行組織染色，結果表明4h時，大多數細胞存在于血管內或者血管周圍，1d和2d時，細胞離開血管，分布到基質中。該文獻首次報道了將肝細胞種植到支架上后白蛋白分泌、尿素合成等功能的發(fā)揮，再種植成功的肝臟被移植到單側腎切除的大鼠體內。Baptista等采用小鼠、大鼠、雪貂、兔和豬，分別經由門靜脈插入不同尺寸的導管，通過蠕動泵以5ml／min的速度注入總量約為40倍肝臟體積的蒸餾水，后以1％的Triton－X100和0．1％氨水灌注肝臟去除細胞，最后以蒸餾水去除殘余洗脫劑。將人臍靜脈內皮細胞和人胚胎肝細胞種植到肝臟支架中，同時通過門靜脈以3ml／min循環(huán)灌注RPMI1640培養(yǎng)基16h，首次證實了人肝細胞前體細胞具有在脫細胞肝臟支架上生存的潛力。功能測定顯示，培養(yǎng)液中的尿素和白蛋白水平明顯高于單純將人胚胎肝細胞置于培養(yǎng)液中的方法。另有文獻報道一種改良的脫細胞方法，以RPMI1640培養(yǎng)基灌洗10min，再用混有SDS的磷脂酶A2沖洗30－60min，直到組織透明，流出液澄清，再以高滲鹽水及核酸酶分別沖洗，直到灌洗液在280nm及260nm的吸光度皆呈陰性，最后以RPMI1640培養(yǎng)基沖洗2h，所制備支架具有將肝臟前體細胞分化成肝細胞和膽管上皮細胞的能力。然而，上述文獻都僅限于嚙齒類動物，Barakat等采用新的方法制備豬脫細胞支架，并進行人肝細胞種植：以SDS進行去細胞，右前葉作為種植細胞的支架，含有肝細胞生長因子的胚胎肝細胞和胚胎星狀細胞作為種植細胞，灌注液中含有肝細胞生長因子和其他所需營養(yǎng)物質，通過測量灌注過程中氧分壓、二氧化碳分壓、乳酸、葡萄糖、尿素氮和白蛋白量進行肝臟代謝和合成功能的評估。結果表明，再生的肝臟呈現活躍的代謝能力，并保留白蛋白的合成能力，種植細胞分化為成熟的肝細胞。因此，ECM對于細胞的種植至關重要，具有支持細胞生長、促進前體細胞特異性分化的作用。Hammond等通過將肝臟脫細胞支架移植到正常肝臟和部分肝切除的肝臟中，證實了這一觀點。首要的觀察指標為肝細胞DNA的合成和肝組織滲透進入支架的程度；其次的觀察指標為非實質細胞的DNA合成、肝重量的測定、肝功能測定以及移植物周邊的細胞生長情況。結果令人振奮，支架種植到正常肝臟4d后，支架周邊有更多的肝細胞增殖，7d后更多的肝臟組織滲透進入支架中；部分肝切除術后2d，種植支架的肝臟較單純部分肝切除的肝臟有更多的肝細胞增殖。

四、前景與展望

將干細胞或者成熟的肝細胞種植到去細胞支架上，并在生物反應器中動態(tài)培養(yǎng)，是肝臟組織工程的基本思路。人或動物來源的全器官脫細胞支架因保留有完整的血管網狀結構，有利于血管系統(tǒng)的再生及營養(yǎng)和氧氣的運輸，較人工合成支架有較大的優(yōu)勢。人源性種子細胞在理論上可以將免疫排斥反應降到最低。再生的器官移植到體內之前，必須明確細胞在支架上所能發(fā)揮的功能及生物相容性。此外，細胞與周圍微環(huán)境間的作用機制、肝臟ECM對細胞活動的調節(jié)作用、相關生長因子所起的作用等，都將是去細胞組織工程肝臟未來研究的方向.

作者：鄔迪單位：，南通大學附屬醫(yī)院普通外科