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          剖析白菜不結球的分子方法

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          剖析白菜不結球的分子方法

          1材料與方法

          1.1材料

          利用江蘇省農業科學院蔬菜研究所十字花科項目組不結球白菜研究材料T青做父本進行轉育,得到F1代。2011年春,將雙親及F1代種植于江蘇省農業科學院蔬菜研究所實驗田。對F1代植株進行自交,得到F2代,F1代單株與不結球白菜親本回交,得到BC1代。田間管理按常規方法進行。

          1.2方法

          1.2.1T青、結球白菜抗源CR、F1、F2及BC1。每個材料3次重復,每次重復30株,隨機排列,播種于50孔穴盤。待苗長到3~4片真葉時移栽營養缽,采用灌根法進行抗性鑒定。用移液器吸取1ml含5×107或1×108個孢子懸浮液10ml,澆注到寄主根際周圍,接菌6周后,洗凈根部泥土,調查單株發病情況,并計算病情指數。田間病情分級參考前人研究分級標準[3],略有改動。分級標準為:0級,未發生病害;1級,根系的須根、側根有較少細小腫瘤,主根未發生病害;2級,根系的須根腫瘤多,側根腫瘤較多,主根發病較輕,微微腫大;3級,根系的主根發病較重,異常腫大,大部分須根、側根腫瘤多;4級,根系的主根異常腫大,根系幾乎無須根。0級為抗病,其他均為感病。

          1.2.2抗感池的構建及引物篩選采用BSA法,在F2群體中分別隨機選取10株抗病單株和10株感病單株,將其DNA等量混合,構建抗病基因池和感病基因池,對引物進行篩選,挑選在抗、感病池間能夠產生特異性條帶的引物。

          1.2.3PCR產物點入含0.5μg/mlEB的2.0%瓊脂糖凝膠中,以DNAmarkerV(Tiangen)作為分子量標準,在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳1h,紫外凝膠成像儀下照相。

          1.2.4ISSR標記的連鎖分析將篩選出的ISSR標記在雙親及F2分離群體中進行驗證,用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。親本為抗病有標記帶和感病無標記帶,F1代為感病有標記帶,F2代中重組型個體為抗病無標記帶、雜合感病無標記帶和純合感病有標記帶,根據F2代中重組型單株的數量計算交換率,再根據Kosambi作圖函數公式換算成Morgan遺傳距離。

          2結果

          2.1F1共接種30株,表現為高抗根腫病(抗性等級為0級)。F2隨機選取73株,54株表現為高抗(抗性等級為0級),其他感病(1株病級為1級,2株病級為2級,16株病級達3級),抗感分離比為54∶19,滿足3∶1(χ2=0.074<χ20.05=3.84)。BC1隨機選取70株,36株表現為高抗(抗性等級為0級),34株感病(2株病級1級,1株病級2級,31株病級達3級),抗感分離比為36∶34,滿足1∶1(χ2=0.057<χ20.05=3.84)。分析各病級范圍內的單株頻數,未發現4級病害的單株。表明該根腫病的抗性受顯性單基因控制。

          2.2分子標記的篩選用90條ISSR引物進行親本PCR擴增,其中21條ISSR引物可以在親本間穩定擴增出清晰多態性條帶,占總引物數的23.0%。將能夠擴增到清晰多態性條帶的引物在抗感池中篩選,結果發現,引物873(5''''-GA-CAGACAGACAGACA-3'''')可以在抗感基因池中擴增出多態性條帶,差異片段分別約為500bp。由于抗根腫病基因是顯性基因,如果標記與抗病基因緊密連鎖,純合抗病株和雜合抗病株都能擴增出此帶,而純合感病株應沒有此帶。利用F2分離群體中的73個單株DNA對候選引物進一步驗證,結果顯示,標記873在54份高抗根腫病單株(抗性0級)中,53個擴增出差異條帶,1個未擴增出差異條帶。同樣19份感病單株中,有6份擴增產生特異條帶。因此共有7株在標記873與抗病基因之間發生重組,交換率為9.59%。依據Kogambi圖函數公式得出標記873與抗根腫病基因之間的遺傳距離為9.72cM,命名為CR-873。

          3討論

          在B.rapa中發現了至少3個主要的根腫病抗性基因,這些基因是相對獨立的,且分別對不同的P.brassicae生理小種發生作用[12-14]。Diederichsen等利用ECD04和DH群體發現了B.napus根腫病抗性由1個主效基因和至少2個隱性基因控制[15]。王芳展等認為,B.rapa大多數抗性基因都來自于歐洲飼料蕪菁,不同的品種獲得了1個或者多個的抗性基因,而這些基因之間又相對保持獨立[16]。本研究通過對抗根腫病多世代群體進行抗性鑒定表明,不結球白菜抗性由顯性單基因控制。Matsumoto等發現了2個RFLP標記與1個CR基因CRa連鎖,并將其定位在R3染色體34cM的位置上[17]。Suwabe等利用SSR標記,發現了Crr1和Crr22個CR位點[18]。Kuginuki等利用Siloga作為抗源,發現了3個RAPD標記與CR位點連鎖[19]。ISSR技術可以比RFLP、SSR、RAPD等技術更多地揭示基因組中的多態性,并比RAPD穩定,比AFLP簡便,是一種很好的DNA指紋標記。本研究采用BSA和ISSR技術相結合來研究與不結球白菜抗根腫病基因連鎖的標記,得到1個與根腫病抗性基因連鎖較緊密的分子標記CR-873,遺傳距離為9.72cM。本研究中得到的CR-873標記與抗根腫病基因的遺傳距離仍然較遠,可能是因為本研究中用于計算遺傳距離的群體偏小,一定程度上影響遺傳距離的準確性。后續研究可以進一步擴大群體并把獲得的可能與抗根腫病基因相連鎖的ISSR標記轉換為更穩定的SCAR標記。

          作者:劉藍單位:河北省農業局