蝙蝠蛾與青霉藥檢測
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本文作者：趙婷、姚粟、李輝、薛強偉、程池單位：中國食品發酵工業研究院中國工業微生物菌種保藏管理中心、山東優福蟲草素生物科技有限公司
蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyceshepiali)為天然冬蟲夏草(Cordycepssinensis)中分離到的內寄生菌,其菌絲體發酵物具有廣泛的藥理活性,如降血脂、止咳祛痰、鎮靜、解痙等[1]。蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)已列入衛生部(2001)84號文件《可用于保健食品的真菌菌種名單》。目前,已實現蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)發酵法生產菌絲體作為冬蟲夏草藥材的替代藥品或保健品[2]。2010年新版GMP實施后,為加強保健食品生產管理,國家食品藥品監督管理局(SFDA)于2011年9月了《保健食品良好生產規范(修訂稿)》征求意見稿,生產企業進行保健食品產品申報時,應遵循:“菌絲體原料、益生菌類原料和藻類原料采購應當索取菌株或品種鑒定報告、穩定性報告和不含耐藥因子的證明材料。”其中,藥敏試驗的要求是從微生物菌種或其代謝產物的食用安全方面考慮,以避免外源耐藥因子帶入體內而引起耐藥性。然而,對于產孢絲狀真菌的藥敏檢測,尤其是應用于保健食品產業的產孢絲狀真菌,目前國內缺乏相關的檢測方法、標準及檢測機構,本文參照美國國家臨床實驗室標準化委員會(CLSI)M38-A2《肉湯稀釋法抗真菌藥敏試驗參考方案》[3]對蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)進行了藥敏檢測,期望為相關檢測方法及標準的建立提供部分技術依據,進而更好地服務于廣大保健食品生產企業。
1材料
1.1試驗菌株蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali),由山東優福蟲草素生物科技有限公司提供。
1.2質控菌株滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)AS2.1846T=ATCC22019T,購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。
1.3抗真菌藥物試驗所用6種抗真菌藥物,均購自中國食品藥品檢定研究院,配制成儲存液置20°C備用,相關信息見表1。
1.4培養基及試劑RPMI-1640液體培養基(含谷氨酰胺,不含碳酸氫鹽,含酚紅作為pH值指示劑),購自美國ThermoFisher公司;沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA),馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA),購自北京陸橋技術責任有限公司;三氮嗎啉丙磺酸(MOPS),購自美國Amresco公司;96孔滅菌酶標板購自美國Costar公司。
2方法
2.1微量藥敏板制備抗真菌藥物按照使用說明操作,直接或80°C干燥至恒重后,稱量0.0160g伊曲康唑、酮康唑、伏立康唑、環吡酮胺,分別溶于10.0mLDSMO中,配制成1600mg/L的存儲液,稱量0.0512g5-氟胞嘧啶、氟康唑,分別溶于10.0mL無菌蒸餾水中,配制成5120mg/L的存儲液,置20°C儲存備用。用DMSO將非水溶性藥物儲存液按1:50稀釋至2倍終濃度,即伊曲康唑、酮康唑、伏立康唑、環吡酮胺為32mg/L,用RPMI-1640液體培養基(以終濃度為0.165mol/L的MOPS為緩沖液,25°C調節pH7.0)將水溶性藥物儲存液按1:40稀釋至2倍終濃度,即5-氟胞嘧啶、氟康唑為128mg/L。取無菌96孔酶標板,在第1孔加入稀釋后的抗真菌藥物200μL,第212孔加入RPMI-1640培養基100μL。從第1孔吸取100μL藥液加入第2孔,充分混勻后吸取100μL加入第3孔,依次做倍比稀釋至第12孔,第12孔的藥液混勻后吸取100μL棄去。配置好的藥敏板從第1孔至第12孔藥物濃度由高到底為320.0156mg/L或1280.0625mg/L。另設空白對照及未加藥物的生長對照,非水溶性藥物對照中加入1μLDSMO。
2.2供試菌株孢子懸液制備將供試菌株蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上25°C培養710d,用1mL無菌0.85%生理鹽水沖洗孢子,轉入無菌試管,靜置5min,取上部均質孢子懸液于另一無菌試管,渦旋振蕩15s,用分光光度計校正孢子懸液濃度至(0.45.0)×104CFU/mL(波長530nm時,OD值為0.090.13)。
2.3孢子懸液濃度質控驗證將蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)孢子懸液梯度稀釋后,取0.01mL涂布于沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA)上,25°C28°C培養15d,菌落計數以驗證孢子懸液濃度。
2.4接種在96孔板的112列孔每孔加入100μL的孢子懸液,25°C靜置培養,48h后觀察結果。
2.5MIC(最低抑菌濃度)值判讀伊曲康唑、伏立康唑MIC值為肉眼觀察100%抑制生長的藥物濃度;環吡酮胺MIC值為肉眼觀察80%及以上抑制生長的藥物濃度;氟康唑、酮康唑MIC值為肉眼觀察50%及以上抑制生長的藥物濃度;5-氟胞嘧啶沒有規定,暫定MIC值為肉眼觀察50%及以上抑制生長的藥物濃度[45]。試驗菌株均做2次重復,試驗結果由至少2人共同判讀,以保證結果的準確性。
3結果
3.1方法質控6種抗真菌藥物對質控菌株滑假絲酵母(C.parapsilosis)ATCC22019T的MIC值檢測結果見表2,質控菌株MIC檢測值均在參考范圍之內,表明實驗操作及結果可信。
3.2接種量經分光光度計測定,試驗菌株蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)孢子懸液在波長530nm時OD值為0.09,經平皿菌落計數驗證,孢子懸液濃度為1.1×104CFU/mL,兩者結果相互吻合。3.3MIC值判讀6種抗真菌藥物對蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)的MIC值檢測結果見圖1,試驗菌株除5-氟胞嘧啶外,其他藥物MIC值拐點均落于設定的藥物濃度范圍之內,5-氟胞嘧啶根據判讀標準MIC值為≥128mg/L。圖2給出了蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)在微量藥敏板上25°C培養48h后的生長照片,直觀地顯示了供試菌株的生長情況,由于菌株生長代謝產酸,可以明顯看出含酚紅作為pH值指示劑的生長孔顏色變黃。CLSIM100-S21《抗微生物藥敏試驗參考方案21版》中規定了紙片擴散法及最低抑菌濃度稀釋法對各類細菌的敏感(Sensitive)、中介(Intermediate)、抗性(Resistant)藥敏判別標準;CLSIM27-A3《酵母的肉湯稀釋法抗真菌藥敏試驗參考方案》中規定了假絲酵母屬(Candidaspp.)及部分真菌的敏感(Sensitive)、劑量依賴型敏感(Sensitive-dosedependent)、中介(Intermediate)、抗性(Resistant)藥敏判別標準。對于產孢絲狀真菌,由于研究進展較緩慢,研究菌株的試驗數據量較少,目前CLSI還未提出判別標準,僅對臨床常用的幾種藥物給出了建議判別標準,但根據M38-A2方法可以得到相關MIC值,MIC值對于菌株的藥物敏感性能描述也是重要的指征,并為今后判別標準的提出積累試驗數據。本試驗參照M38-A2方案步驟對試驗菌株進行2次重復試驗，所得MIC值結果基本相同,驗證了M38-A2方案對于產孢絲狀真菌藥敏性能檢測的可行性。CLSIM38-A2規定的培養溫度為35°C,該培養條件可以促進產孢,但對于少數菌株培養條件可能存在差異,如供試菌株蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)在CLSI標準所述的35°C不生長,因此本試驗采用25°C進行培養及藥敏測試。另外,MIC值拐點的判讀應以抑制菌體生長的最低濃度為標準,不應以pH值指示劑顏色的改變為標準,因為有些菌株伴隨著代謝產酸帶來的顏色改變,而另外一些代謝不產酸的菌株就不會發生顏色改變。
4討論
對于產孢絲狀真菌的液基稀釋抗真菌藥敏試驗參考方案,美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)于1998年了M38-P,于2002年更新為M38-A,于2008年更新為M38-A2。M38-A2被檢測真菌范圍為包括臨床常見侵襲真菌感染菌種的產孢絲狀真菌,不包括非產孢絲狀真菌,也不適應于雙相真菌的酵母相。M38-A2與上一版比較,增加了棘白菌素類藥物最低有效濃度(MEC,minimaleffectiveconcentration)的判別標準,增加了4種藥物的結果判讀及結果解釋,抗真菌藥物更新至14種,質控及參考菌株更新至13株[3]等。本文選取了14種抗真菌藥物中的6種,該6種抗真菌藥物國內有標準品提供,13株質控菌株中的1株,該株質控菌株國內有保藏,其他抗真菌藥物及質控參考菌株都需要引進,然而相應的引進費用高昂、程序繁瑣,是目前建立標準化方法亟待解決的問題之一。目前產孢絲狀真菌抗藥物敏感性試驗研究主要集中在臨床上[6],目的一般是研究開發具有廣譜抗真菌性能的藥物,或對抗真菌藥物的抗菌譜進行監測[4,711]。以應用于保健食品的真菌為研究對象,測定其對不同抗真菌藥物的敏感性,國內還未見報道,一方面也顯示了國家政策文件與相關檢測標準或方法不配套、不同步的矛盾。本研究期望對相關檢測方法的建立提供部分技術依據,但由于受試菌株數量少,無法進行統計學分析,未來需要更多試驗數據的積累,以獲得菌株耐藥敏感性的判別標準,最終服務于廣大保健食品生產企業及檢測機構。
