空氣環境對益生菌影響
前言：本站為你精心整理了空氣環境對益生菌影響范文，希望能為你的創作提供參考價值，我們的客服老師可以幫助你提供個性化的參考范文，歡迎咨詢。
本文作者：其木格蘇都、白梅、孔亞楠、魏愛彬、王記成、張和平單位：青島君益食品有限公司、內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室
乳酸菌是發酵食品中的自然生物防腐劑,而其中的一些菌株對宿主健康有益,被稱為益生菌。發展到現在,由2001年FAO和WHO提出的益生菌定義為大多數學者所認可,即“當給予宿主足夠的量時,可以對宿主起到有益作用的微生物活體”。益生菌制品從最初的亞洲小作坊加工逐漸傳播到歐洲和美國市場,由此而生的功能性食品更是目前增長最快的食品之一[1]。全球工業分析家預測預計到2015年全球益生菌市場將達到288億,即使這樣依然認為該市場還處于起步階段,有著巨大的發展空間。因此,需要更有效、穩定的益生菌及益生菌產品來迎接應對這一挑戰。飲食是攝入益生菌最方便的方式,特別是便于儲存、裝卸、運輸,而且是在保質期內穩定的功能性益生菌食品。乳及其制品是大多數益生菌良好的載體,其中發酵乳是公認最好的載體之一。腸道中足夠的益生菌活菌數是對宿主達到良好益生功效的保證[2],因此各個國家對產品中益生菌的活菌數都有明確規定,其含量不得低于106CFU/mL[3]。雙歧桿菌(Bifidobacterium)的益生特性已被人們普遍接受,但Bifidobacterium屬于專性厭氧菌,在工業化生產時需要解決由于氧中毒而導致其活菌數較低的問題。Miller、CraigWilliam等[45]將高氧氣消耗菌種與雙歧桿菌進行復配,兼性厭氧菌嗜熱鏈球菌(Stretococcusther-mophilus)在生長時能利用溶解氧,可有效保護雙歧桿菌生長,但到發酵后期,S.thermophilus代謝產生的酸會抑制Bifidobacterium生長,所以這種保護只在發酵初期有效,對隨后的加工及貯存期間溶氧起不到作用(酸奶一般用聚乙烯和高聚苯乙烯來包裝,厚度在300μm350μm之間,對酸奶的溶氧率為1.05.0cm2/(kg•d)[6])。Dave和Shah報道將L-半胱氨酸[7]和抗壞血酸[8]作為除氧劑添加到酸奶生產中,L-半胱氨酸是一種含硫氨基酸,既可以降低氧化還原電位,又可以作為一種氨基酸氮源;抗壞血酸是一種常見的食品添加劑,二者都可以減少溶氧維持低的氧化還原電位,有利于Bifidobacterium生長,但會影響到一般酸奶發酵劑中S.thermophilus的生長,進而影響到酸奶的質構和風味,因此對于一般酸奶可能不太適合。微膠囊包埋技術也被用來提高Bifidobacterium活菌數,但多項研究表明微膠囊包埋只對一部分菌有作用,應用受限[9]。Mills等研究發現,直接降低溶氧、氧化還原電位可保護非發酵巴氏殺菌乳在儲存期間的Bifidobacterium活菌數[10],但只能維持原來的接菌量,活菌數不會增加。乳雙歧桿菌V9(B.lactisV9)分離自健康蒙古族兒童糞便,其具有較強的耐酸性,在人工胃腸液中具有良好的耐受性[11]。對致病菌株(志賀氏痢疾桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、埃希氏大腸桿菌)具有一定程度的拮抗作用,可以有效治療小鼠的腹瀉[12]。臨床研究表明,B.lactisV9具有調節腸道菌群的作用,對便秘和急慢性腹瀉患者治療效果顯著,服用B.lactisV93周,對便秘、急性腹瀉和慢性腹瀉患者的治療有效率分別為95.3%、95.4%和89.9%[13]。對其基因組學研究顯示,其菌株遺傳極為穩定,在傳代保藏過程中發生重組、突變幾率極小,可保障其安全生產[14]。本文以上述綜述為出發點,通過改變培養基質中氣體組成,研究B.lactisV9在固體MRS培養基表面和液體MRS及脫脂乳中的生長情況,為其在益生菌制品生產應用開闊思路,并提供理論依據和數據參考。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種來源:B.lactisV9由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種保藏中心(LABCC)提供。
1.1.2試劑和儀器:紐西蘭超特級脫脂乳粉;合成MRS培養基(Oxoid);高純氣體(北京華通精科氣體化工有限公司);REX-C700厭氧培養箱;厭氧指示條(Oxoid,AnaerobicIndicatorBR0055);除氧劑(Oxiod,AnaeroGenAN35);MINIVACPD-52真空泵(Yamato-ULVAC,日本);U-2000型紫外可見分光光度計(HITACHI,日本);1100液相色譜系統(Agilent,美國);NSC-ⅡA-1200無菌工作臺;HA-300M全自動高壓滅菌器(HIRAYAMA,日本)。稀釋液PBS和雙歧桿菌選擇性培養基TPY的配制參照文獻[11]。
1.2方法
1.2.1菌落形成:將真空冷凍保存的B.lactisV9菌粉接種于液體MRS培養基中,37°C厭氧培養活化2代后,劃線于固體MRS培養基上,并將劃線平板分別置于普通培養箱(空氣環境,N2:O2≈79:21)、充氮氣培養箱(N2:99.99%)和混合氣體培養箱(N2:H2:CO2=80:10:10)中,37°C恒溫培養72h,觀察菌落形成狀況。在厭氧培養箱中預置厭氧指示條以檢驗無氧環境。用于劃線的固體MRS培養基預先置于厭氧培養箱24h進行脫氧處理。在厭氧培養時,培養箱中空氣要先充高純氮氣置換2次,然后再充混合氣體或氮氣。保證每次充氣后培養箱為正壓,防止空氣吸入,同時可以在培養期間隨時觀測培養箱的密封情況。另外,培養箱中預先放置除氧劑和厭氧指示條,充氣后指示條的顏色由淺紅色轉變為白色,說明培養箱中為無氧環境。
1.2.2B.lactisV9在MRS液體中生長:B.lactisV9活化方法同1.2.1,跟蹤測定第3代OD600值,取OD600=1.0(Mid-logphase)時培養液以2%(V/V)接種于MRS液體中,分別置于普通培養箱和混合氣體培養箱中,37°C恒溫培養。具體操作方法同1.2.1。每3h測定pH值、OD600值和活菌數,同時留樣測定乳酸和乙酸含量。
1.2.3B.lactisV9在脫脂乳中生長:B.lactisV9活化方法同1.2.1,取第3代OD600=1.0時菌液離心所得菌體,加同體積11%滅菌脫脂乳,以2%接種于巴氏殺菌(95°C,5min)脫脂乳中,分別置于普通培養箱和混合氣體培養箱,37°C恒溫箱中培養。具體操作方法同1.2.1。每6h測定pH值、OD600值和活菌數,同時留樣測定乳酸和乙酸含量。
1.2.4pH值測定:試驗樣品調整溫度至20°C,采用精密pH計(雷磁PHS-3C,海精密科學儀器有限公司)測量。1.2.5濁度測定:MRS培養基樣品適當稀釋后測定,以未加菌的空白樣為參比,采用比濁法于600nm處測定其濁度。
1.2.6活菌數測定:10.0g樣品于90.0gPBS稀釋液中,于水平搖床(200r/min)振搖15min,然后梯度稀釋,采用雙歧桿菌選擇性培養基TPY固體培養基平板傾注法,37°C厭氧(N2:H2:CO2=80:10:10)培養72h。
1.2.7液相色譜法測定乳酸、乙酸含量:準確稱取樣品1g于10mL離心管中,加入3mL1mol/LHCl振蕩混勻,3500×g,離心10min,95°C水浴15min。取上清液經0.45μm膜過濾待進樣分析。色譜條件:流動相:甲醇緩沖溶液(濃度為10mmol/L的PBS,pH2.0)=3:97(V/V),流速為0.5mL/min,紫外檢測波長為210nm,柱溫為35°C,進樣量10μL。1.2.8數據統計分析:試驗數據采用SASANOVA程序處理。
2結果與討論
2.1氣體環境對B.lactisV9菌落形成的影響雙歧桿菌是一類專性厭氧乳酸菌,既沒有呼吸鏈也不含有過氧化氫酶,一般認為是嚴格厭氧的,因此在工業化生產中會出現氧中毒。然而在具體的培養中發現,部分菌株具有氧代謝酶,可以在0.1%21.0%氧氣環境中存活[1519],表明不同的雙歧桿菌菌株對氧氣的耐受能力不同。目前,國內在雙歧桿菌菌種的分離鑒定中較常使用的厭氧氣體組成為N2:H2:CO2=80:10:10[11],同時,越來越多的研究發現,一些雙歧桿菌的氧氣耐受力與二氧化碳有關,即這些菌只在二氧化碳存在時才表現出一定的氧耐受力。對于B.lactisV9,在空氣、氮氣和混合氣體環境中,其菌落形成情況完全不同,見圖1。在混合氣體和氮氣環境中菌落形成明顯多于空氣環境,說明B.lactisV9在很大程度上受到了空氣中氧氣的抑制。B.lactisV9在混合氣體中菌落生長狀況優于氮氣中的,說明單純的無氧環境不一定能保證B.lactisV9的生長處于最佳狀態,還需要考慮無氧氣體環境的組成成分。此結果與ShinjiKawasaki等[20]的報道一致,在無氧條件下,CO2可以促進雙歧桿菌菌落生長,但不會改變菌株的氧氣耐受能力。部分雙歧桿菌菌種在CO2存在時具有一定的氧耐受性,而且可在一定濃度的CO2條件下生長,也是部分雙歧桿菌的分離鑒定依據。CO2刺激菌落形成與一些參與CO2固定、水解和羧基化反應的酶有關。另外,推測可能因為CO2是氧化形式的“C”,可以像氧氣一樣作為電子受體,來維持細胞內氧化還原電位平衡。但CO2促進作用的具體機理還有待研究。本實驗結果表明,B.lactisV9不是嚴格厭氧菌,在空氣環境中有菌落形成,但在混合氣體環境中生長更加良好。
2.2氣體環境對B.lactisV9在液體MRS培養基中生長的影響鑒于2.1的研究結果,采用混合氣體和空氣條件對B.lactisV9的生長進行進一步研究。混合氣體和空氣環境下,B.lactisV9在液體MRS培養基中的生長曲線見圖2。可以看出,在混合氣體環境中,B.lactisV9生長曲線呈“S”型,18h左右是對數生長中期(Mid-logPhase),24h開始進入穩定期;而在空氣環境中,OD600值一直持續緩慢增長,表示B.lactisV9生長明顯受到限制。另外,在混合氣體環境下,由于CO2在液體MRS中的溶解,不接種B.lactisV9的液體MRS作為對照樣培養30h后的pH值從初始6.43降到了6.29。從表1可以看出,接種B.lactisV9培養30h后,混合氣體環境pH值(4.42±0.24)顯著低于空氣環境pH值(5.55±0.24)(P<0.01)。從B.lactisV9的生長趨勢和培養基的pH值變化上可以看出,液體MRS培養基在混合氣體環境下可有效促進B.lactisV9生長。這一點也可以從活菌數變化上得到證實,培養24h后,混合氣體環境中B.lactisV9活菌數(9.11±0.11logCFU/mL)顯著高于空氣環境(8.04±0.10logCFU/mL)(P<0.01)。現有的研究表明,對氧氣敏感的雙歧桿菌在有氧時會積累H2O2,而H2O2會抑制其糖代謝的關鍵酶——果糖-6-磷酸-磷酸酮酶(F6ppk),從而引起氧中毒[17]。在這些反應中,NADH氧化酶、NADH過氧化酶和超氧化物歧化酶(SOD)的作用最關鍵。在一定范圍內增加氧氣的濃度,雙歧桿菌分解H2O2的NADH氧化酶和NADH過氧化酶活力都明顯高于無氧環境[21]。這些酶在兼性厭氧乳酸菌中也存在,并且某些菌株在有氧環境下生長良好,這種對氧氣的耐受能力與菌體內碳水化合物代謝轉變聯系在一起。本研究對培養基中主要的碳水化合物——葡萄糖的代謝產物乳酸、乙酸的含量進行了跟蹤檢測。本實驗所用液體MRS培養基中含有16.70±0.35mmol/L的乙酸(源于添加的無水乙酸鈉),不含有乳酸。培養24h時,去除原來培養基中含有的乙酸,在混合氣體環境下B.lactisV9代謝生成的乙酸和乳酸量分別為12.79±0.86mmol/L和11.99±0.73mmol/L,顯著高于在空氣環境中生成量為0.65±0.07mmol/L和2.75±0.57mmol/L(P<0.01),混合氣體和空氣環境中乙酸/乳酸比值分別為1.06:1和0.24:1。Talwalkar和Kailasapathy研究了4株雙歧桿菌在不同氧環境中的代謝變化,發現每個雙歧桿菌菌株的氧耐受能力不同,如代謝物中乙酸與乳酸的比例隨著環境中氧氣濃度的增加而減少[21]。R.González報道[22],在缺氧條件下,代謝TPYG培養基產乳酸的最大濃度為8.1mmol/L,乙酸/乳酸的摩爾比為3.5:1;而在有氧條件下,乳酸濃度增加超過2倍,乙酸/乳酸下降到1.5:1。本研究發現,液體MRS培養基中乙酸、乳酸產量受氣體組分條件影響,在混合氣體環境下產生的乳酸濃度是空氣環境的4倍左右,而乙酸卻多出約20倍。當有氧培養轉向無氧培養時糖代謝產物會發生變化,主要是乳酸轉化成乙酸,同時伴隨產生2倍的ATP[23]。以上結果可以說明混合氣體環境有利于B.lactisV9在液體MRS培養基中生長,可以有效增加活菌數,代謝產生乙酸、乳酸量增加,且改變了乙酸與乳酸比例。
2.3氣體環境對B.lactisV9在脫脂乳中生長的影響在巴氏殺菌脫脂乳中,B.lactisV9的生長情況與液體MRS培養基中類似,pH值和活菌數變化結果見表2。發酵18h,混合氣體環境pH值(4.48±0.07)顯著低于空氣環境pH值(5.03±0.12)(P<0.01),混合氣體環境的活菌數(9.02±0.15logCFU/mL)顯著高于空氣環境的活菌數(8.53±0.08logCFU/mL)(P<0.01)。混合氣體和空氣環境下發酵脫脂乳產生的乙酸、乳酸量分別為60.52±2.30mmol/L、5.17±1.02mmol/L和16.86±0.34mmol/L、5.92±0.81mmol/L,乙酸/乳酸比值分別為11.71:1和2.85:1。在混合氣體環境下,B.lactisV9發酵脫脂乳(主要是乳糖)生成的乙酸量遠遠多于乳酸。此結果與B.lactisV9在MRS中生長類似,B.lactisV9發酵脫脂乳生成的酸以乙酸為主。Meile等[24]發現乳雙歧桿菌可以耐受反應器頂空10%氧氣,在氧氣環境中乳酸濃度為9.9mmol/L,明顯高于厭氧條件下的5.6mmol/L,乳酸的增量引起了代謝產物中乙酸/乳酸摩爾比的變化,從10.1:1降到4.7:1。這樣的變化趨勢與本實驗結果類似。但是乙酸/乳酸摩爾比的變化范圍相差較大,這可能是由于菌株自身特性、介質中糖濃度不同以及氣體條件不同等因素造成的。從本研究對益生菌B.lactisV9的研究可以看出,無氧環境的氣體組成會影響到B.lactisV9的生長及代謝。目前,我國國標《GB4789.35-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[25]和《GB/T4789.34-2008食品衛生微生物學檢驗雙歧桿菌檢驗》[26]中在對雙歧桿菌計數方法中只提到“厭氧培養48±2h后計數平板上的所有菌落數”,未對具體的氣體環境做出規定。所以對于B.lactisV9而言,同為厭氧條件的純氮氣環境和混合氣體環境,B.lactisV9的菌落形成明顯有差異,這樣就有可能在執行標準時因為厭氧氣體組成的不同造成B.lactisV9活菌計數結果的不同。誠然,雙歧桿菌活菌計數結果還受其他諸多條件影響,正如劉偉等所報道的“雙歧桿菌目前還沒有一套準確和嚴格的計數方法”[27],這就需要人們進一步全面地探索研究。
3結論
本研究通過在固體MRS培養基、液體MRS培養基及巴氏殺菌脫脂乳接種乳雙歧桿菌BifidobacteriumlactisV9(B.lactisV9),研究不同氣體環境對B.lactisV9生長及代謝的影響。研究顯示,B.lactisV9不是絕對厭氧菌,混合氣體(N2:H2:CO2=80:10:10)環境可有效促進其菌落形成,更有利于其在MRS液體和巴氏殺菌脫脂乳中生長。此混合氣體環境,可應用于益生菌制劑及制品的生產。這一研究結果可為B.lactisV9益生菌發酵乳的生產和產品中B.lactisV9活菌培養計數提供指導。此外,氣體組成條件對代謝產物中乙酸/乳酸摩爾濃度比變化的影響,為改善益生菌產品口感提供新思路和可行性證據。綜上研究可見,環境中氣體組成影響著B.lactisV9的生長速度及代謝組成,但具體的相關關系和作用機理尚不明確,仍需深入研究。
