介導Pr1基因在腐霉的表達

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本文作者：劉萍1鄭慧玲2趙竟男3吳建偉4蘇曉慶1

作者單位：1.貴陽醫學院生物學教研室2.貴陽市婦幼保健醫院優生遺傳科3.艾迪康臨床檢驗所有限公司4.貴陽醫學院寄生蟲學教研室

貴陽腐霉Pythiumguiyangense是貴陽醫學院于1994年分離得到的一株滅蚊真菌[1]。經課題組實驗研究證實它具有滅蚊能力強、繁殖速度快、易于人工培養[2]、可移植性強以及對非靶生物相對安全等諸多優點[34]。然而,和其它昆蟲病原真菌一樣,貴陽腐霉也具有毒力不穩定、擊倒害蟲所需時間較長、對環境依賴性強以及長期人工傳代菌株退化等缺點,要將其開發成生物防治劑,真正用于蚊蟲生物防治,目前還有許多工作要做。在基因工程技術廣泛應用于生物遺傳改造的今天,采用基因轉化技術培育新菌株是可行的。

昆蟲病原真菌入侵靶標昆蟲過程中分泌一系列蛋白質酶、幾丁質酶和脂酶等體壁降解酶降解昆蟲體壁,與菌絲產生的機械壓力協同作用,穿透昆蟲體壁并在蟲體內寄生,耗竭昆蟲營養,甚至產生次生代謝產物,從而導致靶標昆蟲的死亡。在此過程中,類枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin-likeprotease,Pr1)是降解昆蟲體壁的重要參與者[5]。St.Leger將構巢曲霉組成性啟動子控制下的多拷貝金龜子綠僵菌Pr1基因轉入綠僵菌基因組,在煙草天蛾血淋巴中實現高效表達,增強了綠僵菌的毒力,使殺蟲時間縮短了25%,并使蟲體取食能力大大降低[6]。該結果表明,Pr1蛋白酶基因在綠僵菌中的超表達可以明顯提高該菌的毒力。本課題組前期克隆得到1519bp的貴陽腐霉Pr1蛋白酶基因序列,其中包含一個969bp的完整的開放閱讀框[7]。在此基礎上,我們希望利用基因工程技術將貴陽腐霉的Pr1蛋白酶基因轉入貴陽腐霉中超量表達,以期獲得高毒力的工程菌。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌種與質粒:貴陽腐霉來源于貴陽醫學院蚊蟲生物防治實驗室;根癌農桿菌LBA4404和質粒pUC18由貴州大學趙德剛教授惠贈;pSK-hph由西南大學生物技術研究中心張永軍教授惠贈;pAN7-1由黃雋老師惠贈;pCambia-Pnos-PNN-hph由本實驗室構建[8];引物合成與測序由上海英駿(Invitrogen)公司完成。

1.1.2蚊蟲:實驗所用蚊幼蟲為本實驗室馴化后傳代飼養的致倦庫蚊Culexquinquefasciatus貴陽株。

1.1.3常用培養基:KPYG2培養基(g/L):蛋白胨1.50,酵母浸出粉1.50,葡萄糖3.00,膽固醇0.025,氯化鈣0.11,玉米油1.00?；钧}培養基(g/L):MgSO4•7H2O0.3,KH2PO40.3,NaCl0.3,葡萄糖5.0。誘導培養基(g/L):MgSO4•7H2O0.3,KH2PO40.3,NaCl0.3,幾丁質2.0,蟬蛻2.0,pH6.0。YEP培養基(g/L):蛋白胨10.0,酵母提取物10.0,氯化鈉5.0,pH7.2。IM培養基(g/L):KH2PO41.45,K2HPO42.05,NaCl0.15,MgSO4•7H2O0.50,(NH4)2SO40.50,CaCl20.07,FeSO4•7H2O0.003,C6H12O6•H2O1.80,甘油5mL,蒸餾水定容至940mL,1×105Pa高壓滅菌20min,冷卻后加入濾過除菌的40mL1mol/LMES和20mL10mmol/L乙酰丁香酮(AS)。

1.1.4主要試劑:Taq酶、dNTP、T4DNA連接酶、各限制性內切酶、CIAP、DNAmarker等購自TaKaRa公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒、質粒提取試劑盒、潮霉素B等抗生素購自Solarbio公司。底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA、左旋多巴(L-3,4-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA)等購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1貴陽腐霉Pr1基因的克隆:根據貴陽腐霉Pr1蛋白酶基因序列(序列分析無內含子)自行設計引物pr1-F:5-CGCGGATCCGACCCATTCCGAAAGTCCAAG-3,5端引入BamHⅠ酶切位點;pr1-R:5-GGAAGATCTTACAACCGTCCTCCTAACAC-3,5端引入BglⅡ酶切位點。尿素法提取貴陽腐霉基因組DNA[9],以其為模板,擴增Pr1基因片段。PCR反應條件:94°C5min;94°C45s,59°C1min,72°C1min,共30個循環;72°C10min。

1.2.2組成性表達載體pCambia-hph-Pr1的構建:用限制性內切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切質粒pSK-hph,回收TtrpC片段(770bp),與用相同酶切的質粒pUC18連接轉化,重組載體命名為pUC18-TtrpC。以貴陽腐霉基因組DNA為模板擴增Pr1片段,切膠回收,以限制性內切酶BamHⅠ和BglⅡ雙酶切,得到Pr1片段(1100bp),與相同酶切的載體pUC18-TtrpC連接轉化,重組載體命名為pUC18-TtrpC-Pr1。以質粒pAN7-1為模板,擴增Pgpd段(約2.1kb),回收該片段,用KpnⅠ和BamHⅠ酶切,與相同酶切的載體pUC18-TtrpC-Pr1連接,命名為pUC18-PgpdA-pr1-TtrpC。用HindⅢ單酶切pUC18-PgpdA-Pr1-TtrpC,回收約4.0kb片段,與相同酶切的pCambia-Pnos-PNN-hph連接轉化。獲得組成性表達Pr1的載體pCambia-hph-Pr1,凍融法轉入根癌農桿菌AgrobacteriumtumefaciensLBA4404中[10],70°C保存。

1.2.3根癌農桿菌介導的pr1基因在貴陽腐霉的遺傳轉化:按龍朝欽等[11]方法稍改動。取含質粒pCambia-hph-Pr1的LBA4404過夜培養物,用含200μmo1/LAS的YEP液體培養基28°C振蕩培養6h后,與貴陽腐霉菌絲混合,26°C培養24h。棄上清,加入含200μmo1/LAS的IM培養基,26°C培養48h。懸浮沉淀,將該混合物涂布到KPYG2平板上(含200mg/L潮霉素B和200mg/L頭孢霉素),26°C培養直至抗性菌絲長出。

1.2.4潮霉素抗性基因hph的PCR檢測:引物hphR:5-TTCGATGTAGGAGGGCGTGGAT-3;hphF:5-CGCGTCTGCTGCTCCATACAAG-3。分別以貴陽腐霉野生株和轉化株基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR條件:94°C4min;94°C45s,60°Clmin,72°C1.5min,共35個循環;72°C10min。

1.2.5Pr1蛋白酶活性測定:野生株和轉化株分別在誘導培養基和基本鹽培養基中振蕩培養24h。取培養液4°C、13000r/min離心,上清液即為粗酶液。利用專一性短肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA進行Pr1蛋白酶活性測定[12]。酶活單位定義為在pH8.0、28°C條件下,每分鐘每毫克總蛋白的A410增加0.1所需的酶量?？捡R斯亮藍法測定蛋白含量,計算比酶活。

1.2.6游動孢子的誘發與計數:接種貴陽腐霉于KPYG2培養基上培養7d后,30mL滅菌蒸餾水中放入直徑15mm的2個菌絲塊,25°C靜置24h,輕搖燒瓶,取50μL液體并加入10μL棉藍染液,混勻,放置1015min。顯微鏡下計數游動孢子[2]。

1.2.7生物測定－滅蚊實驗:貴陽腐霉接種于KPYG2培養7d后。取塑料杯,盛入100mL水,加入25只二齡致倦庫蚊幼蟲和直徑為15mm的2塊菌絲塊,加入6滴4%兔肝粉懸液。設空白對照。每天觀察一次,取出死亡幼蟲鏡檢,體內有菌絲者即為感染幼蟲;無菌絲者保濕培養24h再鏡檢,如有菌絲亦為感染。連續觀察10d[2]。

1.2.8感染蚊蟲酚氧化酶的測定:取貴陽腐霉轉化株和野生株處理5d的蚊幼蟲各20只,加入pH6.0的磷酸鹽緩沖液1mL,冰上研磨。4°C、12000r/min多次離心,最終所得澄清液即為蚊蟲粗酶液。酚氧化酶活性測定:取粗提液100μL,再加入0.01mol/L反應底物L-DOPA100μL。一個酶活單位定義為室溫下每分鐘每毫克總蛋白的A490改變0.001所需的酶量?？捡R斯亮藍法測定蛋白含量,計算比酶活[13]。

1.3統計學處理

實驗數據經SPSS11.5電腦統計軟件分析處理。

2結果

2.1Pr1組成性表達載體pCambia-hph-Pr1的構建與酶切驗證

按方法1.2.1擴增貴陽腐霉Pr1基因片段,獲得大小約1100bp的片段,與預期片段大小一致。測序結果經BLAST比對與貴陽腐霉Pr1已知序列相同。按方法1.2.2構建了以潮霉素抗性基因hph為篩選標記,將目的基因Pr1置于真菌組成性啟動子PgpdA之下,構建了表達載體pCambia-hph-Pr1(圖1)。用BamHⅠ酶切pCambia-hph-Pr1進行驗證,切下大小分別約為16.3kb和2.8kb的條帶(圖2),與載體酶切位點和預期片段大小相符。將該載體導入根癌農桿菌LBA4404菌株中,用于貴陽腐霉的遺傳轉化。

2.2貴陽腐霉轉化株的獲得及鑒定

按1.2.3方法,在選擇培養基上培養23d,可見貴陽腐霉菌絲生長。隨機挑取這些潮霉素抗性菌絲轉接至新的含有200mg/L潮霉素B的選擇培養基上時,正常生長的菌絲體初步確定為轉化子。提取抗性菌株基因組DNA,以基因組DNA為模板,潮霉素抗性基因設計的引物進行PCR檢測,電泳如圖3顯示,貴陽腐霉野生型菌株沒有擴增到特異性條帶,而抗性菌株均擴增到約780bp的目的條帶。

2.3貴陽腐霉轉化株的穩定性檢測

將轉化子在不含潮霉素B的KPYG2培養基上培養,連續轉接10代,然后再接種到含有不同濃度潮霉素的培養基上培養,測量72h后菌落直徑[14]。貴陽腐霉野生株生長隨著潮霉素B濃度的增高受到抑制,當潮霉素B濃度達到150mg/L時,生長完全受到抑制。貴陽腐霉轉化株的生長情況與潮霉素B濃度無相關性,與野生株在非選擇培養基上的生長狀況無明顯差別(表1),表明轉化子是可以穩定遺傳的。

2.4轉化株Pr1蛋白酶分析

在含蟬蛻的誘導培養基中,轉化株的Pr1蛋白酶活性水平略高于野生株,但統計學分析無顯著性差異。在含葡萄糖的基本鹽培養基(非誘導培養基)中轉化株產生的Pr1蛋白酶水平顯著高于野生型菌株(表2)。2.5貴陽腐霉轉化株菌絲游動孢子產量統計學分析表明野生株與轉化株的游動孢子產量沒有顯著性差異(表3)。

2.6貴陽腐霉轉化株滅蚊毒力檢測

轉化株的平均滅蚊效果比野生株滅蚊效果增強了近一倍,達到約33%,其中最高能達到約54.7%,兩者比較差異有顯著性意義。對蚊幼蟲化蛹率的統計分析表明,轉化株處理的幼蟲化蛹率顯著低于野生株和空白對照處理的幼蟲(表4)。死亡蚊幼蟲鏡檢觀察,對照組死亡蚊幼蟲尸體腫脹發白,表面無菌絲生長。野生株處理組死亡蚊幼蟲尸體彎曲,94%尸體表面有菌絲體生長。轉化株處理組死亡蚊幼蟲尸體明顯黑化,僅5.4%尸體表面可見菌絲體生長。

2.7貴陽腐霉轉化株對蚊幼蟲體酚氧化酶活性的影響

貴陽腐霉野生株和轉化株處理的蚊幼蟲,其酚氧化酶活性顯著高于空白對照組,而轉化株處理的蚊幼蟲酚氧化酶活性數據高于野生株,但差異不顯著(表5)。

3討論

本實驗中獲得了遺傳穩定的貴陽腐霉轉化株,在非誘導培養基中產生Pr1蛋白酶活性顯著高于野生株,說明轉入的Pr1蛋白酶基因在非誘導的條件下能夠組成性的表達。而在蟬蛻誘導培養基中,轉化株的Pr1蛋白酶活性雖然在數據上要高于野生株,但統計學分析表明這種差異不顯著。這與方衛國研究球孢白僵菌組成性表達類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1及幾丁質酶基因Bbchit-1工程菌株的結果相似[15]。這有待于采用實時熒光定量PCR或者Western-Blotting等方法進一步驗證,以檢測在基本鹽和誘導培養基的條件下,貴陽腐霉野生型菌株和轉化株Pr1基因轉錄mRNA或表達Pr1蛋白酶水平的差異。游動孢子是貴陽腐霉產生的侵染蚊幼蟲的單細胞結構,結果顯示轉入的Pr1基因并未影響貴陽腐霉的產孢能力和生長能力。

2007年貴陽腐霉野生型菌株對致倦庫蚊幼蟲的生物測定顯示,其感染率為23.7%±13.0%[2],與最初分離時比較有顯著降低。而目前,貴陽腐霉野生型菌株對致倦庫蚊幼蟲的感染率僅為16.7%±13.0%。在長期實驗室人工傳代培養的過程中,菌株毒力退化明顯。因此我們期望采用菌株復壯、細胞工程和基因工程技術等技術以提高菌株的毒力。利用根癌農桿菌介導的Pr1基因在貴陽腐霉的遺傳轉化方法,獲得的轉化株處理的蚊幼蟲死亡率明顯提高。我們推測了以下幾個原因:(1)在貴陽腐霉的野生型菌株,Pr1蛋白酶基因需要在昆蟲體壁的誘導下才能表達,因此只有在游動孢子附著在昆蟲體壁上時,分泌Pr1蛋白酶作用昆蟲體壁局部。而轉化株可組成性表達Pr1蛋白酶,在游動孢子附著前可能已表達Pr1蛋白酶,而游動孢子附著后也誘導Pr1蛋白酶的產生,使其更快速入侵并萌發生長,耗竭昆蟲營養。(2)入侵后的轉化株在昆蟲血腔內仍然組成性表達Pr1蛋白酶,可能破壞寄主的正常生理活動,降低其免疫力。(3)St.Leger提出在感染昆蟲晚期,當酚氧化酶水平明顯降低的時候才在血淋巴中產生Pr1,顯示出酚氧化酶具有抵抗Pr1的蛋白水解作用[6]。在轉化株處理蚊幼蟲過程中,產生了更多的酚氧化酶,以抑制超表達的Pr1蛋白酶的水解作用,同時,酚氧化酶水平升高也導致了其氧化后醌水平的升高,引起蚊幼蟲醌中毒。

染病的蚊幼蟲,取食量下降,生長速度明顯減緩,最終死亡。轉化株處理的蚊幼蟲的酚氧化酶活性數值雖然高于野生株處理組,但是差異不顯著,這與St.Leger的結果不一致?？赡苁怯捎赟t.Leger采用直接注射Pr1蛋白酶,且煙草天蛾幼蟲體積大,易于獲取足量的血淋巴用于檢測,而蚊幼蟲(孑孓)體積小,難以獲得足夠測試數量的血淋巴。因而我們采用孑孓的整體研磨液,得到的粗酶液里包含了血漿、血細胞、表皮和組織中的PO,因此檢測的是總PO活性。這也可能是導致貴陽腐霉無論野生型抑或轉化菌株對蚊幼蟲的殺滅效率偏低的原因。