腸道環(huán)境論文:果膠對腸道環(huán)境的影響

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作者：呂嬌蘇昕峰方國珊劉雄單位：西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院

大量的研究表明，果膠作為腸道益生因子，有利于腸道中乳酸菌、雙歧桿菌的生長，產(chǎn)生豐富的SCFAs（short-chainfattyacids）改善腸道pH，促進腸細胞生長，抑制結(jié)腸癌等[5-8]。前人研究結(jié)果暗示果膠可能具有改善辣椒素引起的腸道環(huán)境的不適癥狀。薛荔做為一種野生常綠攀援植物常見于我國各省，適應(yīng)力強，易于種植。并且瘦果籽中含有豐富的果膠，研究表明薛荔籽果膠酯化度為38.57%，屬于酸性低酯果膠[9]。因此，本實驗選擇薛荔籽果膠作為添加物，考察果膠添加是否會改善辣椒素引起的腸道不適。由于體外發(fā)酵作為動物實驗的補充有很多優(yōu)點：它可以跟蹤發(fā)酵過程中物質(zhì)的變化及研究發(fā)酵產(chǎn)物的形成過程，彌補了體內(nèi)發(fā)酵不能實現(xiàn)動力學(xué)檢測的缺點；它還可以實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作，實驗的重復(fù)性強。因此，本文擬采用體外發(fā)酵試驗觀察果膠與辣椒素對腸道發(fā)酵環(huán)境的影響，以期為辣椒的科學(xué)消費提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1材料與試劑薛荔果膠由實驗室研究自制。天然辣椒素(辣椒堿含量為95.7%)由河南倍特生物科技有限公司提供。氯化鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、硫酸（優(yōu)級純）、亞硝基鐵氰化鈉（分析純）、苯酚（分析純）、次氯酸鈉（分析純）、冰乙酸（分析純）、吐溫80（分析純）、氯化銨（分析純）、咔唑（分析純）成都市科龍化工試劑廠；乙酸(色譜級)AJohnsonMattheyCompany；巴豆酸（色譜級）、丙酸(色譜級)、丁酸(色譜級)、異丁酸(色譜級)梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；EMB培養(yǎng)基（生化試劑）北京奧博星生物技術(shù)有限公司；BS培養(yǎng)基（生化試劑）、LBS培養(yǎng)基（生化試劑）青島海博生物技術(shù)有限公司；D-半乳糖醛酸（分析純）北京索萊寶科技有限公司；高純二氧化碳氣體（99.999%）重慶朝陽氣體有限公司。

1.2儀器與設(shè)備Sepctrumlab22可見分光光度計上海棱光技術(shù)有限公司；WH-1微型旋渦混合儀上海滬西分析儀器廠；JA2003A電子天平上海精天電子儀器有限公司；DHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計上海大普儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市富華儀器有限公司；5810型臺式離心機德國Eppendorf公司；SIGMA低溫離心機德國SIGMA公司；ARI14紫外分光光度計上海愛朗儀器有限公司；GC-2010氣相色譜日本島津公司；KQ-100超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HH-B11電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進醫(yī)療器械廠；BC-J160S二氧化碳細胞培養(yǎng)箱上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋KAGOSHIMASEISAKUSYOINC；ZHWY-100C恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智誠分析儀器制造有限公司；Stabilwax-DA毛細色譜柱美國RESTEK公司。1.3試驗方法

1.3.1果膠提取與測定

1.3.1.1果膠提取[10]稱量薛荔籽，在水浴鍋中提?。弦罕龋?:10（m:V）、60℃攪拌2h）。方法一：真空濃縮濾液——真空冷凍干燥——粉碎——成品薛荔籽膠。方法二：AB-8型大孔樹脂脫色過濾——真空旋轉(zhuǎn)濃縮至1/3——用95%乙醇沉析，靜置一夜——用65%乙醇洗滌兩次——真空冷凍干燥——粉碎——成品薛荔籽果膠。

1.3.1.2果膠純度測定[11]標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱取D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用蒸餾水定容于100mL容量瓶中，制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取上述標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于25mL具塞刻度試管中，再加入蒸餾水稀釋至1mL，即得一組濃度為0、20、40、60、80、100μg/mL的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液。然后小心沿管壁分別加入6.0mL濃硫酸，在沸水浴中加熱20min，取出冷卻至室溫，再分別加入0.2mL，1.5g/L咔唑-乙醇溶液，搖均。在暗處放置30min，取出測定反應(yīng)液在波長526nm處的吸光度，用蒸餾水做空白實驗，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0116x–0.002，R2=0.9981。稱取10mg實驗室自制薛荔籽果膠，溶解后定容至100mL容量瓶中，吸取1mL果膠溶液至25mL比色管做上述處理，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算D-半乳糖含量。

1.3.2發(fā)酵液制備

1.3.2.1發(fā)酵液配比通過查閱大量相關(guān)文獻及本研究室前期的實驗表明，對采用不同劑量灌喂一月后的大鼠進行詳細的檢測后，發(fā)現(xiàn)添加5%果膠就能明顯增加大鼠盲腸內(nèi)容物中SCFA總量，而添加0.1%辣椒素組的大鼠其血脂變化及對腸道的傷害作用最為明顯。發(fā)酵液各物質(zhì)添加量見表1。其中果膠根據(jù)接種盲腸內(nèi)容物重量的5%添加，辣椒素根據(jù)發(fā)酵液總體積添加（m:V），添加量為0.1%。

1.3.2.2體外發(fā)酵步驟1)無菌條件下取出6只雄性大鼠的盲腸內(nèi)容物，裝入預(yù)先滅菌的50mL帶蓋離心管中，稱重，鼓入高純CO2氣體5min，蓋上蓋子待用。2)用9倍(V:m)無菌生理鹽水稀釋盲腸內(nèi)容物，渦旋震蕩5min混勻，4層紗布過濾。3)取12支100mL高溫滅菌后的高溫瓶，每支高溫瓶中加入5mL盲腸內(nèi)容物濾液和45mL滅菌基礎(chǔ)培養(yǎng)液（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g，pH7.0~7.2，定容至1000mL），將高溫瓶分為4組（每組3支），按實驗要求分別加入果膠或辣椒素（見表1），鼓入高純CO2氣體20min，蓋好橡膠塞后蠟封。在60~80r/min轉(zhuǎn)速的恒溫培養(yǎng)振蕩器上37℃搖床培養(yǎng)10h，終止發(fā)酵，檢測發(fā)酵液中pH、游離氨、SCFA及微生物。

1.3.3生化指標(biāo)檢測

1.3.3.1pH測定發(fā)酵液樣品5mL于4000r/min下離心5min，吸取上清液2mL，用精密酸度計測上清液pH。

1.3.3.2發(fā)酵液游離氨測定無氨水制備[12]：在1000mL蒸餾水中，加入0.10mL硫酸（ρ=1.84g/mL）。并在全玻璃蒸餾器中重蒸餾，棄去前50mL餾出液，然后將餾出液收集在帶有玻璃塞的玻璃瓶中。發(fā)酵液樣品于4000r/min下離心5min，吸取上清液1mL，依次加入1mL含有0.001mol/L亞硝基鐵氰化鈉的0.5mol/L苯酚溶液和1mL含有0.03mol/L次氯酸鈉的0.625mol/L氫氧化鈉溶液，60℃保溫5min，625nm波長下測吸光度[13]。配制5mmol/L氯化銨溶液，分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL溶液于4mL比色皿中，無氨水稀釋至1.0mL，按上述步驟測吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.108x+0.008，R2=0.9991。

1.3.3.3發(fā)酵液SCFA測定盲腸內(nèi)容物發(fā)酵液樣品在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至超純水預(yù)處理過的10mL離心管中，10000r/min轉(zhuǎn)速下繼續(xù)離心15min，1mL一次性注射器吸取上清液1mL，0.22μm濾膜過濾至2mL進樣小瓶中待測[14]。氣相色譜條件：進樣量1μL；進樣口溫度220℃；柱流量0.95mL/min，柱溫90℃、平衡時間0.5min，5℃/min升溫至150℃，保留時間7min；檢測器溫度230℃；氫氣流量40mL/min，空氣流量400mL/min，尾吹流量40mL/min[15]。

1.3.3.4發(fā)酵液微生物測定取發(fā)酵液1mL，加入9mL無菌生理鹽水，依次10倍稀釋至10-7。選擇10-5、10-6、10-7三個稀釋度，用于大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的培養(yǎng)計數(shù)，接種量為100μL。大腸桿菌培養(yǎng)選用EMB培養(yǎng)基，37℃下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時計數(shù)。雙歧桿菌和乳酸桿菌分別選用BS培養(yǎng)基和LBS培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿蠟封后，在37℃下二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)72小時計數(shù)。結(jié)果以logcfu/mL表示。

1.4統(tǒng)計分析實驗結(jié)果以mean±SD表示，各組間顯著性差異采用SPSS分析，P<0.05被認為有顯著差異。

2結(jié)果與分析

2.1薛荔籽果膠純度稱取10mg薛荔籽果膠溶于100mL蒸餾水中，取1mL果膠溶液，按照3.2.1.2方法測得吸光度為0.11，對應(yīng)D-半乳糖醛酸含量為9.655μg/mL。果膠純度為96.55%。

2.2發(fā)酵液pH變化趨勢pH以盲腸內(nèi)容物量計算，各發(fā)酵液pH變化見圖1。從圖1可以看出：在各發(fā)酵液的初始pH值為5.9的條件下，實驗結(jié)果顯示，相比空白組而言，添加5%果膠的發(fā)酵液（P組）pH顯著降低，而添加0.1%辣椒素的發(fā)酵液（C組）pH則顯著升高（P<0.05）。添加5%果膠+0.1%辣椒素的發(fā)酵液（P+C組）pH相比0.1%辣椒素組（P組）顯著降低。發(fā)酵液中pH值的變化主要是由發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸和游離氨所影響，pH的降低或升高表明有機酸含量或游離氨濃度可能發(fā)生了顯著的變化。

2.3發(fā)酵液游離氨變化趨勢果膠和辣椒素對盲腸內(nèi)容物發(fā)酵液中游離氨濃度的影響結(jié)果見圖2。從圖2可以看出：相對于空白組，添加5%果膠（P組）能顯著降低的發(fā)酵液中游離氨濃度，而添加0.1%辣椒素（C組）則明顯增加了的發(fā)酵液游離氨濃度（P<0.05）。相對于辣椒素組（P組），添加5%果膠+0.1%辣椒素（P+C組）則明顯降低了辣椒素引起的游離氨濃度的升高（P<0.05）。這與發(fā)酵液中pH值的升高和降低相對應(yīng)。

2.4發(fā)酵液短鏈脂肪酸變化趨勢果膠對辣椒素引起的盲腸有機酸發(fā)酵產(chǎn)物減少的改善效果見圖3、圖4、圖5及圖6。從圖中可以看出：與對照組相比，添加5%果膠（P組）的盲腸內(nèi)容物發(fā)酵液中乙酸、丁酸、丙酸和總短鏈脂肪酸濃度均顯著升高（P<0.05），而添加0.1%辣椒素組（P組）則顯著降低了盲腸內(nèi)容物發(fā)酵液中乙酸、丁酸、丙酸和總短鏈脂肪酸濃度（P<0.05）。添加5%果膠+0.1%辣椒素的發(fā)酵液（P+C組）的短鏈脂肪酸含量相比0.1%辣椒素組（P組）顯著升高（P<0.05）。此結(jié)果表明，辣椒素抑制了腸道益生菌對碳水化合物的發(fā)酵，減少有機酸的產(chǎn)生，而添加果膠能夠有效改善辣椒素對腸道益生菌發(fā)酵所產(chǎn)生的不利影響。2.5發(fā)酵液微生物數(shù)量變化趨勢果膠和辣椒素對盲腸內(nèi)容物發(fā)酵液中微生物組成的影響見圖7、圖8及圖9。從圖中可以看出：相對于對照組，添加5%果膠組（C組）能顯著增加發(fā)酵液中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，減少大腸桿菌的數(shù)量，而辣椒素組(P組)則減少了發(fā)酵液中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，增加大腸桿菌的數(shù)量（P<0.05）。添加5%果膠+0.1%辣椒素發(fā)酵液（P+C組）的乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量相比0.1%辣椒素組（P組）顯著升高，而大腸桿菌數(shù)量則顯著降低（P<0.05）。此結(jié)果表明，辣椒素抑制了腸道益生菌的生長，同時使得有害菌的數(shù)量增加，而添加果膠能夠有效改善辣椒素對腸道微生物菌群所產(chǎn)生的有害作用。

3結(jié)論與討論

隨著人們健康意識的增強，以及營養(yǎng)科學(xué)和醫(yī)藥科學(xué)的發(fā)展，有關(guān)食用辣椒對人體健康的利與弊的話題，成為人們關(guān)注的一個焦點。國內(nèi)外研究表明：辣椒素藥理作用廣泛，在鎮(zhèn)痛方面有重要作用，同時具有防治心血管疾病、呼吸道疾病的作用，還能用于減肥[16]、治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病等[17]。然而，許多食用辣椒的消費者會出現(xiàn)腸道不適，尤其是初次食用或過量食用的消費者，會出現(xiàn)腹痛、拉肚、肛部灼燒感等癥狀。多數(shù)研究表明灌喂辣椒素對人體腸道有不良影響，且與食用劑量有正相關(guān)關(guān)系，辣椒素主要通過對腸道的化學(xué)刺激起作用[18-19]。也有研究發(fā)現(xiàn)辣椒素可以刺激腸絨毛增生，促進小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而對腸道健康也起到積極的改善作用[20-21]。然而，腸道菌群對腸道健康至關(guān)重要。本研究結(jié)果表明，辣椒素可以使盲腸內(nèi)容物發(fā)酵液中有益菌（乳酸桿菌、雙歧桿菌）數(shù)量減少，有害菌（大腸桿菌）數(shù)量增加，導(dǎo)致腸道短鏈脂肪酸濃度降低，游離氨濃度升高，pH值升高。這可能是辣椒素會引起消費者出現(xiàn)腸道不適癥狀的原因。而相同劑量辣椒素的盲腸內(nèi)容物發(fā)酵液中，添加果膠可以使發(fā)酵液pH值和游離氨濃度降低、短鏈脂肪酸濃度升高，說明果膠體外發(fā)酵對辣椒素引起的盲腸內(nèi)容物發(fā)酵環(huán)境惡化有一定的改善作用。其原因可能是果膠體外發(fā)酵產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸，使發(fā)酵液中pH值降低，有益菌（乳酸桿菌、雙歧桿菌）數(shù)量增加、有害菌（大腸桿菌）數(shù)量減少，游離氨濃度升高。因此，添加果膠可以緩解由辣椒素引起的腸道環(huán)境惡化。