農田徑流N和P消除模擬研究
前言：本站為你精心整理了農田徑流N和P消除模擬研究范文，希望能為你的創作提供參考價值，我們的客服老師可以幫助你提供個性化的參考范文，歡迎咨詢。
本文作者：李明堂劉夢洋曹國軍趙蘭坡作者單位：吉林農業大學資源與環境學院
水土流失及溶質遷移是耕地，尤其是坡耕地土壤質量退化的主要原因之一，同時也是農業面源污染及其導致的自然水體質量惡化的重要因素。目前，國內外學者在這方面的研究主要集中在不同耕作和降雨條件下農田氮磷的流失機理、土壤－作物系統氮磷損失的定量評價和估算、氮磷流失對天然水體的影響等方面［1－4］。而關于受高氮磷含量農田徑流污染水體的凈化研究相對不足。黑土是松遼平原玉米帶的主要土壤，由于長期連作和化肥投入量逐年增多，導致土壤水土流失嚴重，尤其是大量的氮磷進入封閉或半封閉水域后對水體富營養化的貢獻日益突出，成為農業面源污染急需解決的問題之一［5］。我國東北的黑土區低溫期長，且無植被時風蝕、雨水侵蝕和雪融水侵蝕導致大量的氮磷進入水體中。由于無水生植物的吸收凈化作用，這些營養物質在水體中不斷積累，成為水華爆發的內源污染負荷［6］。因此，減少非水華爆發期時水體中營養鹽的內源負荷對降低水體富營養化水平將會產生積極意義。耐冷菌是指能在0～5℃生長繁殖，最高溫度可達20℃以上的一類微生物，由于其具有抵抗環境變化的自我保護機制，所以在低溫環境中占據獨特的生態位并發揮重要作用［7］。研究表明，耐冷菌在低溫環境中可保持較高的生長和代謝活性，能有效去除污水中的有機物和氮磷［8－9］。異養微生物在反硝化過程中不僅能從水體中脫除氮，而且會消耗大量的有機物，甚至會通過反硝化聚磷作用明顯降低上覆水中磷酸鹽的濃度，因此在治理受污染水體和凈化水質方面正引起人們的重視［10－12］。本文模擬研究了1株從富營養化水體中分離得到的反硝化聚磷菌在不同條件下對農田徑流污染水體中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的去除特征，以期為受納農田徑流的富營養化水體的治理提供技術支持和理論依據。
1材料與方法
1．1實驗用接種液
所用菌株為課題組從低溫富營養化水體中分離出的1株耐冷反硝化菌，16SrRNA序列分析表明該菌株屬不動桿菌屬，與約氏不動桿菌的親緣關系最近，將其命名為DBP－3，Genbank的登錄號為JN314436，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（保藏號為CGMCC4753）。10℃時，在基礎培養基中菌株能在好氧和缺氧條件下以硝酸根或亞硝酸根為電子受體進行反硝化作用，好氧時可過量吸收磷酸鹽聚集于細胞內，厭氧時有明顯的釋放磷現象。實驗前將保存于斜面的菌株挑取1環，接種于反硝化液體培養基中，在10℃和低溶解氧下靜置培養至對數生長期時于8000rpm下離心5min收集菌體，用無菌水洗滌菌體后，再懸浮于無菌水中，制成接種液（600nm處吸光度約為0．3），使用時接種量為1％（V／V）。液體培養基：NaAc1．0g，KH2PO40．1g，MgSO4•7H2O0．2g，NaCl0．2g，（NH4）2SO42．0g，CaCl2•2H2O0．025g，微量元素溶液1．0ml，蒸餾水1000ml，pH＝7．2。微量元素溶液：EDTA10．0g，ZnSO42．2g，CaCl25．5g，MnCl2•4H2O5．06g，FeSO4•7H2O5．0g，（NH4）6Mo7O2•4H2O1．1g，CuSO4•5H2O1．57g，CoCl2•6H2O1．61g，蒸餾水1000ml，pH＝7．2。
1．2農田地表徑流的收集
選擇吉林農業大學玉米試驗田作為農田地表徑流的收集場所。2010年5月于大雨的前1d布下農田徑流收集裝置。在田間的低洼處挖1坑（60cm×60cm×60cm），放入5L的雨水收集器。在收集器頂部遮蓋以收集器為圓心，半徑為1m的圓形遮雨布，使得下雨期間，收集器周圍1m內無降雨，以便流入收集器的地表徑流中能更多地溶解氮磷等營養物質。收集器盛滿地表徑流后，將其取出拿回實驗室，靜置10min，再用中速濾紙過濾，收集濾液與富營養化水以1∶1的比例混合，作為實驗用水，其中硝酸鹽氮濃度為5．78mg／L，溶解性正磷濃度為0．56mg／L。將水樣保存于－20℃冰箱中，所有實驗在2個月內完成。
1．3菌株好氧脫氮除磷實驗
1．3．1培養條件和水樣預處理
向水樣中接種后，在10℃下振蕩培養（150rpm），同時設不接種的對照處理。定期采集水樣，過0．45μm濾膜抽濾后測定硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的濃度。
1．3．2菌株對水樣中氮磷的去除及其定殖能力
分別向原水樣和滅菌水樣（121℃高壓蒸汽滅菌）中接種并培養，在培養的第2，4，6，8天采集水樣，進行硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的測定。每天采集水樣并測定投加菌株的菌體細胞數量和細菌總數。
1．3．3其他條件對菌株脫氮除磷能力的影響
溫度：原水樣接種后分別在5，10，25℃下培養，5d后采樣測定氮磷濃度。鹽度：按照0％，1％，5％和10％的比例（m／V）向原水樣中分別添加氯化鈉，然后再加入接種液，10℃培養5d，采樣測定氮磷濃度。農藥：分別將多菌靈和毒死蜱制成濃度為1000mg／L的儲備液，梯度稀釋后添加于原水樣中，2種農藥的最終濃度都為0，20．0，40．0，60．0，80．0，100．0mg／L，接種后培養5d，測定氮磷的濃度。多菌靈的儲備液用稀鹽酸溶液和甲醇配制，毒死蜱的儲備液用氯仿配制。1．4分析測定方法硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽分別采用酚二磺酸分光光度法和鉬銻抗分光光度法［13］測定。菌體細胞數量測定采用梯度稀釋平板計數法，培養基為加入1．8％瓊脂的反硝化液體培養基和牛肉膏蛋白胨固體培養基。每種處理3次重復，結果為各項指標的平均值。
2結果與分析
2．1菌株對水樣中氮和磷去除的作用
將滅菌水樣＋菌和原水樣＋菌2種處理及只有滅菌水樣或原水樣的2種對照處理在10℃下避光培養，定期采集水樣并測定硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的濃度，以研究菌株的脫氮除磷能力，結果如圖1所示。從圖中可看出，整個實驗周期內，與未投加菌株的對照處理相比，投加菌株后培養體系中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的去除率和去除速度明顯增加。菌株對滅菌水樣和原水樣中硝酸鹽氮的最終去除率分別為78．5％和70．2％，對溶解性正磷酸鹽的去除率分別為82．4％和74．6％，菌株對水樣中磷的去除能力稍大于對氮的去除能力。在未投加菌株情況下，原水樣培養一段時間后，硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的濃度仍有一定程度降低，而滅菌水樣中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽濃度變化不明顯。可以推斷，低溫條件下投加的菌株對水樣中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的去除起主要作用，菌株可通過反硝化作用和聚磷作用快速降低水中的氮和磷；同時原水樣中存在一些其他生物，隨著培養時間延長，這些生物不斷吸收或轉化水體中的硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽，對水樣中氮和磷的去除也起到一定的作用。但由于低溫條件下，其他生物的代謝活動緩慢，因此實驗周期內對照處理中營養鹽的去除效果不明顯。以上結果說明，菌株在強化修復低溫富氮磷水體方面具有一定的應用潛力，但須采取一些其他措施進一步提高菌株的脫氮處理能力，如菌株的固定化等。
2．2菌株在原水樣中的定殖
向原水樣中接入菌種，在10℃下培養，定期采集水樣，通過平板計數法分析水樣中投加菌株的數量動態變化及占水樣中細菌總數的百分比，結果如圖2所示。表明，菌株加入到水樣中后，在整個培養期間內數量上呈現緩慢上升和快速下降的過程，但在培養末期數量仍然可達4×105CFU／ml。實驗初期菌體細胞數量增加不明顯，但從第2天到第4天數量增加相對較快，說明菌株加入到水樣中后具有一定的生存優勢。隨著營養物質的逐漸消耗和其他低溫生物的競爭導致在培養后期菌株出現數量快速下降現象。整個培養過程中菌株占水樣中細菌總數的比例范圍為68．3％～89．1％，說明菌株在低溫微生物生態系統中可占據數量上的優勢，在實際生物修復中可對自然環境產生較強的適應能力，具有明顯的應用優勢。測定采用梯度稀釋平板計數法，培養基為加入1．8％瓊脂的反硝化液體培養基和牛肉膏蛋白胨固體培養基。每種處理3次重復，結果為各項指標的平均值。
2結果與分析
2．1菌株對水樣中氮和磷去除的作用
將滅菌水樣＋菌和原水樣＋菌2種處理及只有滅菌水樣或原水樣的2種對照處理在10℃下避光培養，定期采集水樣并測定硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的濃度，以研究菌株的脫氮除磷能力，結果如圖1所示。從圖中可看出，整個實驗周期內，與未投加菌株的對照處理相比，投加菌株后培養體系中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的去除率和去除速度明顯增加。菌株對滅菌水樣和原水樣中硝酸鹽氮的最終去除率分別為78．5％和70．2％，對溶解性正磷酸鹽的去除率分別為82．4％和74．6％，菌株對水樣中磷的去除能力稍大于對氮的去除能力。在未投加菌株情況下，原水樣培養一段時間后，硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的濃度仍有一定程度降低，而滅菌水樣中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽濃度變化不明顯。可以推斷，低溫條件下投加的菌株對水樣中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的去除起主要作用，菌株可通過反硝化作用和聚磷作用快速降低水中的氮和磷；同時原水樣中存在一些其他生物，隨著培養時間延長，這些生物不斷吸收或轉化水體中的硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽，對水樣中氮和磷的去除也起到一定的作用。但由于低溫條件下，其他生物的代謝活動緩慢，因此實驗周期內對照處理中營養鹽的去除效果不明顯。以上結果說明，菌株在強化修復低溫富氮磷水體方面具有一定的應用潛力，但須采取一些其他措施進一步提高菌株的脫氮處理能力，如菌株的固定化等。
2．2菌株在原水樣中的定殖
向原水樣中接入菌種，在10℃下培養，定期采集水樣，通過平板計數法分析水樣中投加菌株的數量動態變化及占水樣中細菌總數的百分比，結果如圖2所示。表明，菌株加入到水樣中后，在整個培養期間內數量上呈現緩慢上升和快速下降的過程，但在培養末期數量仍然可達4×105CFU／ml。實驗初期菌體細胞數量增加不明顯，但從第2天到第4天數量增加相對較快，說明菌株加入到水樣中后具有一定的生存優勢。隨著營養物質的逐漸消耗和其他低溫生物的競爭導致在培養后期菌株出現數量快速下降現象。整個培養過程中菌株占水樣中細菌總數的比例范圍為68．3％～89．1％，說明菌株在低溫微生物生態系統中可占據數量上的優勢，在實際生物修復中可對自然環境產生較強的適應能力，具有明顯的應用優勢。
2．3溫度對菌株脫氮除磷作用的影響
向原水樣和滅菌水樣中加入菌懸液，分別在5，10，25℃下培養5d后采集水樣，測定硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的濃度，分析不同培養溫度下菌株對水樣中氮磷的去除，同時設不加菌的對照處理（圖3）。結果表明，隨著溫度升高，模擬系統中氮磷的去除率逐漸增加。但5℃時菌株仍保持活力，原水樣和滅菌水樣中硝酸鹽氮的去除率分別為26．7％和29．4％，溶解性正磷酸鹽的去除率分別為37．4％和23．5％，與未投菌的對照處理相比差異顯著；25℃時，投菌的原水樣和滅菌水樣中硝酸鹽氮的去除率分別為76．3％和69．2％，溶解性正磷酸鹽的去除率分別為83．6％和72．5％。可以推斷低溫條件下（5℃和10℃）水樣中去除的氮磷主要是投加菌株的作用，水中的其他生物活性很低，對氮磷去除的貢獻及其與投加菌株的競爭能力可忽略。隨著溫度升高，其他生物的活性開始恢復，對水樣中氮磷的去除有一定的貢獻，而投加菌株的生態優勢逐漸失去。
2．4鹽度對菌株脫氮除磷作用的影響
分別按照質量體積比為0％，1％，5％和10％的比例向水樣中加入氯化鈉，研究鹽度對水樣中菌株脫氮除磷能力的影響，結果如圖4所示。從圖中可看出，氯化鈉濃度為1％時，菌株對培養體系中氮磷的去除能力未受到任何影響，當鹽濃度達5％時，培養體系中氮磷的去除率開始有所下降。當鹽度達10％時，菌株的脫氮除磷能力受到明顯抑制。天然水體的鹽度會因融雪劑的使用、河流徑污比的降低和污水處理廠出水的排放等原因而增加，從而對微生物的生長代謝活動產生影響［14］。研究表明，菌株DBP－3對鹽度具有一定的耐受性，當氯化鈉濃度達10％時菌株的除磷能力才受到顯著影響，因此該菌株對水體中鹽濃度沖擊的忍受能力可能較強，應用價值高。
2．5農藥對菌株脫氮除磷作用的影響
多菌靈和毒死蜱2種農藥對菌株脫氮除磷能力的影響特征如圖5所示。從圖中可看出，低濃度的多菌靈對菌株的脫氮除磷能力無明顯不利影響，甚至具有一定的促進作用，但隨濃度增加，對菌株生長代謝作用的影響越來越明顯，當濃度達到60．0mg／L時，菌株的脫氮除磷能力開始受到不利影響，達到100．0mg／L時，菌株基本失去對氮磷的去除能力，從培養體系的濁度變化可看出，菌株的生長被完全抑制。與多菌靈相比，當毒死蜱濃度為40．0mg／L時，菌株的脫氮除磷能力就開始受到影響，隨著毒死蜱濃度增大，菌株的脫氮除磷能力逐漸減低；當毒死蜱濃度增大到80．0mg／L時，菌株的脫氮除磷能力受到極強的抑制。通過以上分析可看出，菌株對多菌靈和毒死蜱具有一定的抗性，只有在較高濃度時多菌靈和毒死蜱才對對菌株的氮磷去除能力產生明顯的抑制，因此在實際應用中基本不會產生影響，但值得注意的是，毒死蜱對菌株的毒性作用大于多菌靈。
3結論與討論
（1）農業面源污染不僅使得土壤質量因大量氮和磷的流失而日益下降，而且這些營養鹽會通過各種途徑進入天然水體中，加速了水體的富營養化進程，對飲用水安全和生態系統健康構成了嚴重威脅，成為急需解決的問題之一。我國北方，尤其是東北地區低溫期時，地表無植被覆蓋，風、雨水和雪水沖刷極易導致土壤中營養物質流失，但由于水體中無水華現象，因此水體中營養鹽的積累問題往往容易被人們忽視。低溫菌和耐冷菌由于具有較強的低溫適應能力，在水環境中營養鹽的去除方面正引起人們的重視。本文研究了通過低溫定向馴化技術從富營養化水體中分離出的1株土著耐冷菌對農田徑流污染水體中硝酸鹽和溶解性正磷酸鹽的去除特性。結果表明，該菌株在模擬系統中具有較強的適應能力，能夠明顯去除導致水體富營養化的關鍵營養因子，對常見的水體環境因子鹽度和農藥具有一定的抗性，具有廣闊的應用前景。（2）實際應用過程中由于多種環境因子同時起作用，以及其他生物對營養物質的競爭，單一菌株的生態優勢往往容易發生變化。因此，下一步應從菌群的角度進行研究，發現不同微生物間的功能關系，從而在實際應用過程中讓優勢菌處于適宜的生態幅內，使其發揮最大的脫氮除磷能力。同時，由于聚磷作用主要發生在氧氣相對充足的情況下，因此可通過微生物固定化作用，讓其處于高溶解氧環境，以便保持高效的氮磷代謝能力。
