剖析葡萄酒酒香酵母屬
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1904年由HJELTECLAUSSEH在葡萄酒不良風味的研究中首次提出了酒香酵母屬（Brettanomyces）這類微生物[4]。隨著研究人員在葡萄酒的研究中發現了越來越多酒香酵母屬的種，著名的是VanderWalt和VanderKerken發現酒香酵母屬中的2種Brettanomycesbruxellensis和Bret-tanomycesintermedius具有產生子囊孢子的形式。最終在1964年被Walt提出一種具有產子囊孢子形式的酒香酵母屬，也被稱為德克酵母屬（Dekkera）[5]。酒香酵母屬常被稱為一種敗壞酵母，但是在葛有輝等[6]中描述了酒香酵母屬的產香機理，這說明酒香酵母屬對葡萄酒的香氣形成有密切關系。酒香酵母屬中的糖苷酶可以把用于發酵釀造的原材料中存在有結合態糖苷鍵形式的風味前體化合物分解，釋放出具有揮發性的香氣成分，增加了酒的香氣[6]。但是在葡萄酒釀造過程中，其酒香酵母屬代謝產物不單單指這些香氣成分，同時在酒體產生了以4-乙基苯酚（4-Ethylphenol，4-EP）和4-乙基愈創木酚（4-Ethylguaiacol，4-EG）的風味特征為典型代表的一類不良風味。4-EP和4-EG的風味特征是塑料燃燒味、草藥味、馬廄味等[7]。由揮發酚和某些脂肪酸等共同作用形成的一種特殊的風味，形成了酒香酵母屬的風味特征，這就增加了葡萄酒風味特征的復雜性。
一份葡萄牙人的研究表明來自不同國家的葡萄酒中，超過25%的紅葡萄酒中的4-EP的含量超過人的嗜好閾值620μg/mL，高于這一閾值時一些消費者會拒絕飲用該產品[8-9]。酒香酵母屬的代謝產物經化學分析得出的數據是可靠，但是用感官評定來評定這些代謝產物大部分是不確定的。例如，CHATONNETP等[10]報道了紅酒中4-EP和4-EG的覺察閾值分別為605μg/mL和100μg/mL。當這兩種物質在紅酒中并存時，4-EP的覺察閾值會降低，加上不同的葡萄酒就有不同的閾值，從而很難定義這些閾值。一般來說，酒香酵母屬產生的代謝產物的風味強度，個人的嗜好閾值和飲食習慣將決定了人們對酒香酵母屬誘導的風味的可接受性。
2酒香酵母屬的生理特征
CONTERNOL等[11]研究了在葡萄酒中B.bruxellensis菌株的遺傳與生理特征得知，選葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖和海藻糖分別作為碳源，大部分的酒香酵母屬菌株是可以生長的。但是其他糖類如阿拉伯糖、乳糖和棉子糖分別作為碳源，大部分的酒香酵母屬菌株是呈現不生長的狀態。同樣在糖醇類核糖醇、甘油、甘露醇的條件下，大部分的酒香酵母屬菌株也是呈現不生長的狀態。很少的酒香酵母屬菌株能生長在乳酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸等有機酸的條件下。有報道稱，乙醇作為唯一碳源大約有25%的酒香酵母屬菌株可以生長的，而不到10%的菌株可生長在可溶性淀粉中。所有的菌株能夠生長在纖維素或酒石酸作為唯一碳源的條件下。所有的菌株也可以使用精氨酸和脯氨酸作為碳源。研究發現生物素和維生素B1是所有菌株生長的必需營養成分[12]。脯氨酸，精氨酸都可以作為所有酒香酵母菌屬的氮源，硝酸鹽可以作為大多數的菌株在生長測試中作為唯一氮源。酒香酵母屬有較高的產醋酸能力，能耐較高的酒精度，甚至在14%~14.5%的酒精濃度下也可繼續生長繁殖。雖然其發酵能力較弱，但產生的酒精量不少[13]。酒香酵母屬菌株在pH值為2.5條件下都能生長，在pH值為2.0時，其中的94%能生長。多于1/3的菌株能在37℃中生長，低于1/3的菌株能在10℃中生長，在10℃和37℃之間的條件下，酒香酵母屬菌株卻很少能生長繁殖[11]。在葡萄酒釀造過程中，酒香酵母屬極易產生以4-乙基苯酚和4-乙基愈創木酚為典型的風味特征的一類不良風味，是葡萄酒感官品質的重要影響因素，4-乙基苯酚的風味特征為多酚/草藥味，而4-乙基愈創木酚的風味特征多為丁香/假日香料味[14]，4-乙基苯酚和4-乙基愈創木酚的濃度和兩者之間比例對葡萄酒的風味有著重要影響，兩者之間細微的差異也能被感官評價小組或者消費者所察覺。
3葡萄酒易受酒香酵母菌屬污染的原因
從葡萄園到葡萄酒灌裝各個環節中都極易受到酒香酵母屬的污染。一是葡萄園管理上不佳，容易受到酒香酵母屬的侵襲。二是在葡萄酒釀造過程中，如釀酒設備的清洗和殺菌不夠徹底，或者使用已經被酒香酵母屬污染的酒桶，那酒香酵母屬就可存在于葡萄酒釀造的各個階段。目前，[15]。其中Bret-tanomycesbruxellensis是瓶裝酒中引起葡萄酒風味劣變的關鍵微生物。這是由于布魯塞爾酒香酵母對酒精有較高的耐受力，據統計，Brettanomycesbruxellensis在葡萄酒中能耐酒精度高達14%~14.5%[16]。在容許有較低糖分的條件下，它在酒精發酵的整個過程中都能生長，通過產生乙酸減緩酵母屬菌的生長[17]，最后會壓倒且替代了發酵主力微生物釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）[18]。三是如果葡萄酒長時間陳化，尤其是高品質的葡萄酒，易受酒香酵母屬感染，這是B.bruxellensis的生長特征緩慢導致的結果。四是酒體有較低的酸度、高含量的多酚化合物給酒香酵母菌屬生長繁殖提供了良好的環境，還有橡木桶的老化同樣是其生長繁殖的好環境。
4酒香酵母屬不良風味抑制方法的研究進展
有關酒香酵母屬所產生不良風味的研究已成為世界性的課題[19]，酒香酵母屬的風味特征是影響世界上葡萄酒生產的各個區域，很多研究者認為抑制酒香酵母屬不良風味的研究是現代急需解決的課題，這對減少世界范圍內葡萄酒產業不良風味的產生，降低葡萄酒產業的經濟嚴重損失具有特殊的意義[20]。目前，綜合國內外文獻報道，在葡萄酒釀造的整個過程中，原料、設備的選擇，酒曲、酒精度、酸的含量、溫度、氧容量等都可以考慮為抑制葡萄酒不良風味產生的因素[21]，以及外加如二氧化硫、焦糖酸二甲酯（VelcorinTM）等都可作為其抑制試劑。本文分別從這些因素和外加試劑來綜述抑制酒香酵母屬不良風味的方法。盡管這些方法不能完全消除酒香酵母屬不良風味物質，但是可以減少其不良風味物質的濃度，從而減少酒香酵母屬不良風味對釀酒工業的不利影響。
4.1抑制酒香酵母屬不良風味的因素
4.1.1原料、設備的選擇B.bruxellensis主要被發現于葡萄的表皮、陳釀的橡木桶以及葡萄酒中。因此滅菌法是抑制葡萄酒中不良風味的第一步。從葡萄園到灌裝的整個環節都有抑制不良風味物質的考慮因素。第一葡萄不要選腐爛葡萄，因為腐爛葡萄酒上已經被酒香酵母屬酵母菌感染了，即使殺菌也不能徹底消滅它，有研究者發現酒香酵母屬酵母菌在含酸量高的條件下不能生長，所以可選用較酸的葡萄作為原料。第二釀酒設備需要徹底的清洗和殺菌，最重要的是不能使用已被污染的酒桶。據研究者發現，酒香酵母屬能穿透酒桶深度達到8mm處生長并且繁殖[22]，一旦酒桶被B.bruxellensis感染上，即使清洗、殺菌甚至削桶或者其他的技術方法都不能將酒香酵母屬酵母菌從酒桶中徹底消除[23]，例如，已被酒香酵母屬污染的酒桶用臭氧處理，也是只能可以延遲B.bruxellensis的生長而不是徹底消除它[24]。
4.1.2氧氣和濕度葡萄酒釀制過程中都可以為B.bruxellensis的生長提供良好的條件，尤其是發酵時期。研究發現，葡萄酒中的酒香酵母屬代謝產物4-乙基苯酚和4-乙基愈創木酚與酒體中氧容量呈正相關，而與地窖濕度呈負相關[25-26]。這是因為氧氣能促進B.bruxellensis的生長，而濕度大都抑制酒香酵母屬酵母菌的生長可能是因為酒桶中的酒缺乏蒸發，減少了酒與氧氣的接觸面積。目前，國內外大部分葡萄酒工業在葡萄酒生產工藝的整個流程中都采取相應的措施來降低氧氣的濃度。研究發現，在葡萄破碎、果汁分離、過濾等工藝都要避免與空氣的接觸，尤其是在葡萄酒陳釀過程中采用了氮氣排除酒體中氧氣的生產工藝，從而降低了酒體中的氧容量，在瓶裝工藝中采用酒桶平倉裝酒，同時要注意濕度應設為55%，這樣有利于減少酒與氧氣的接觸面積，從而抑制B.bruxellensis的生長。在產品儲存的環境濕度應為70%[27]。平倉裝酒、用氮氣排氧等工藝技術都是比較成熟的。
4.1.3酒精度與酸的含量據發現，提高酒體中的酒精度可以抑制風味前提物質的產生，但是，B.bruxellensis能耐較高的酒精度，甚至在14%vol~14.5%vol的酒精度下能生長繁殖，但是也要考慮到酵母菌的活力與酒精度的耐受性密切相關[28]。不管在酵母菌的活力上受到限制，還是考慮到酒精度太高對葡萄酒風味的影響，只從單方面的提高酒體的酒精度來抑制酒香酵母屬的生長和繁殖是不行的。因此，在葡萄酒生產工藝上是極少用到這個方法的。在釀酒過程中，選用含酸量較高的葡萄或者加入弱酸等方法可以抑制B.bruxel-lensis的生長，例如，山梨酸可以作為抑制風味前提物質生產的抑制劑，但是B.bruxellensis酒香酵母屬對山梨酸抑制有較強的抗性。因此，葡萄酒釀酒師應該必須清楚其最合適的添加量[29]。但也有一些研究認為抑制B.bruxellensis的生長與酒體中的含酸量無關[30]。因此，單利用這些方法去抑制不良風味產生的葡萄酒企業是很少的。
4.1.4溫度據研究發現，多于1/3的酒香酵母屬菌株能在37℃中生長，低于1/3的菌株能在10℃中生長，在10℃和37℃之間的條件下，酒香酵母屬菌株卻都很少能生長繁殖[11]。從這個角度考慮，葡萄酒釀制過程的溫度應控制在10℃~37℃之間，但是也要考慮釀酒酵母發酵溫度，葡萄酒的發酵溫度一般在20℃至30℃之間，并且要保持穩定發酵溫度在這個范圍內，才能使酒發酵的狀態最佳。因此，葡萄酒產業在葡萄酒發酵工藝上采用自動制冷系統控制發酵溫度在20℃~30℃范圍內，不僅使酒發酵最佳，而且能有效的控制酒香酵母屬不良風味的產生。在陳釀過程中應保持在10℃~12℃，產品儲存應在12℃~15℃，這兩個溫度范圍都能有效抑制酒香酵母屬生長和繁殖[11，27]。葡萄酒釀制過程中的制冷系統技術是很成熟的。
4.2外加試劑減少酒香酵母屬不良風味
4.2.1二氧化硫布魯塞爾酒香酵母（B.bruxellensis）可存在于葡萄酒釀造的各個階段，如酒精發酵、乳酸發酵時期等[31]。有研究者發現，向發酵罐中加入足量的二氧化硫并且在發酵過程中維持一定的濃度，可以抑制B.bruxellensis有害微生物的生長。這是因為有一定濃度的二氧化硫可以使B.brux-ellensis進入一種存活但不繁殖的狀態[32-33]。如果在陳釀的過程中把剩下的二氧化硫排空的話，這些有害酵母菌仍存活在酒體中繼續生長繁殖[34]。因此，在葡萄酒整個釀制過程中，在發酵罐中應加入二氧化硫并保持一定的濃度。研究發現，除了酒體中的pH值較高的情況下，一般的酒體中加入的二氧化硫的濃度應在30mg/L以上[35]。因此，在葡萄酒釀制過程加入二氧化硫是減少酒香酵母屬不良風味濃度的適合方法。
4.2.2羥基肉桂酸脫羧酶（HCDC）外加相關的酶對酒香酵母屬不良風味的抑制也不失一種好方法。例如，向富含香豆酸和葡萄花青素的原葡萄汁中加入適量的羥基肉桂酸脫羧酶進行發酵，目的是為了生成更多的苯乙烯基吡喃花青素產物[36]。因為此產物可以使葡萄酒色澤穩定和降低4-EP和4-EG的形成，從而降低4-EP和4-EG的濃度[37]。
4.2.3焦糖酸二甲酯（VelcorinTM）酒體中含有一定的糖分或者酒不要過濾處理，常可以加入焦糖酸二甲酯（VelcorinTM）進行酒的保藏。這是由于焦糖酸二甲酯（VelcorinTM）可以使B.bruxellensis失活，而其他釀酒酵母可能會在酒中啟動再發酵過程。減少不良風味物質的產生，抑制發酵過程中B.bruxel-lensis的生長繁殖，這是抑制風味物質劣變的必要條件。可以從物理化學角度去考慮，比如過濾、蛋白質澄清酒體，雖說過濾和澄清通常被認為對酒的品質上是不利的，但是這些處理酒體可以減少B.bruxellensis的水平[38]。這些方法雖然都不能消除B.bruxellensis產生的不良風味物質，但是可以降低其濃度達到人們可以接受的水平。目前最有效的方法是這些方法的綜合而不是單一使用。例如，首先對設備、原材料進行清洗和殺菌，最好不用已經被污染的酒桶，使用適量的二氧化硫，酒桶平倉裝酒，使用種子培養基可以減少內源性發酵，從而減少B.brux-ellensis生長繁殖的可能性。
5展望
目前，國內對B.bruxellensis不良風味的抑制方法僅有少量文獻報道。而酒香酵母屬B.bruxellensis對葡萄酒的污染是普遍的世界性的問題，易受到B.bruxellensis的感染主要原因是其較低的酸度和高含量的多酚化合物及橡木桶的老化，還有B.bruxellensis緩慢生長特征使那些高品質的葡萄酒更容易受到其污染。因此，B.bruxellensis的存在使葡萄酒工業面臨著嚴重的經濟損失。通過本論文的綜述，對國內葡萄酒工業由酒香酵母屬不良風味的抑制有所借鑒，從而降低葡萄酒工業的成本，滿足國內人們對葡萄酒日益增加的需求，提高了我國葡萄酒在國際市場的競爭力。但是目前國內外抑制方法的研究并不系統化，而且還有存在一些有待進一步檢驗的結論，例如，抑制B.brux-ellensis的生長與酒體中的含酸量是否相關等，還有對不良風味較成熟的抑制方法更加優化還需要努力去研究。
作者:林文華游雪燕馮濤單位:上海應用技術學院香料香精技術與工程學院上海應用技術學院工程創新學院
