少兒AL基因表達研究

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本文作者：趙曉莉潘凱麗錢新宏李迎俠杜莉王英娟羅建峰張垚強歡作者單位：第四軍醫大學西京醫院兒科

分組：(1)alL組32例，男23例，女9例，年齡1．7～14歲，中位年齡4歲。低危10例，中危14例，高危8例。其中B-ALL26例，T-ALL6例。(2)AML組15例，男8例，女7例，年齡2．5～9歲，中位年齡5歲。其中M26例，M35例，M53例，M71例。(3)對照組20例，男12例，女8例，年齡4個月至14歲，中位年齡4歲。其中非惡性血液病骨髓標本5例，門診體檢正常兒童外周血標本15例。樣本的采集均征得患兒家長或患兒本人同意。

免疫分型及融合基因檢測：所有AL患兒均在初發時采集骨髓液1～1．5mL，用流式細胞儀進行免疫分型，根據白血病細胞表面抗原表達類別分為T-ALL、B-ALL、AML;采集骨髓液3mL進行BCR/ABL融合基因及染色體(9，22)異位的檢測，所有AL患兒BCR/ABL融合基因及染色體(9，22)異位的檢測呈陰性。

儀器及試劑：基因擴增儀MiniCyclerTM購自MJRESEARCH公司;JS-380全自動數碼凝膠成像分析儀購自上海培清科技有限公司。Trizol總RNA提取試劑，cDNA第一鏈合成試劑盒，2×TaqPCRMasterMix均購自TIANGENBIOTECH公司。

方法：

（1）提取單個核細胞。用常規Ficoll密度梯度離心法分離患兒或對照組骨髓或外周血的單個核細胞，－80℃冰箱凍存，用于總RNA的提取。

（2）RNA提取及定量。取出－80℃冰箱凍存有單個核細胞的EP管，室溫自然解凍后，加入1mLTrizol，用漩渦振蕩器充分振蕩混勻，室溫放置5min;每使用1mLTrizol加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3min;4℃12000轉/分(rpm)離心10min，把水相約600μL轉移到新的EP管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置30min;4℃12000rpm離心10min，離心后在管側和管底形成膠狀沉淀;加入1mL4℃冰箱預冷的由DEPC稀釋的75%乙醇溶液洗滌沉淀，4℃5000rpm離心3min，小心倒出液體，室溫放置晾干(約1～2min)，加入30μLRNase-freeddH2O，反復吹打、混勻，充分溶解RNA。取1μL總RNA溶液用RNase-freeddH2O稀釋到100倍，用紫外分光光度儀測定總RNA的量，OD260的值在0．1～1．0之間，OD260/280的比值在1．7～2．0之間;取4μL制備好的RNA，在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，結果有28s、18s、5s三條帶。

（3）cDNA的合成。將RNA反轉錄為cDNA，反應體積為50μL:標本總RNA2μL，隨機引物2μL，dNTP2μL，補RNase-freeddH2O定容至14．5μL;70℃加熱5min，迅速在冰上冷卻2min;加入4μL5×First-StrandBuffer，0．5μLRNasin，再加入1μLTIANScriptM-MLV，充分混勻;EP管置于25℃溫浴10min，42℃溫浴50min，95℃加熱5min終止反應;置冰上用RNase-freeddH2O將反應體系稀釋至50μL，－80℃冰箱凍存備用。

（4）引物合成。Notch1和Jagged1基因引物及內參照β-actin基因引物由北京Promega公司合成。見表1。

（5）二步法RT-PCR反應液配制:反應體系25μL，包括反轉錄的cDNA2～5μL，primer1(10μM)1μL，primer2(10μM)1μL，2×MasterMix12．5μL，補RNase-freeddH2O至25μL。(2)反應條件:Notch1:94℃預變性5min;94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環;最后72℃延伸10min。Jagged1:95℃預變性3min;95℃變性30s，65℃退火45s，72℃延伸45s，40個循環;最后72℃延伸10min。β-actin:94℃預變性3min;94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環;最后72℃延伸10min。

（6）PCR產物分析。取PCR產物5μL，在15g/L瓊脂糖凝膠上電泳(80v)，35min后紫外線拍照儀中讀取結果。采用RT-PCR檢測Notch1基因和Jagged1基因表達的電泳結果，以同時出現目的基因及β-actin基因電泳條帶時，判斷該標本Notch1基因(或Jagged1基因)表達陽性。以β-actin作為內參照基因，應用GlykoBandscanversion5．0凝膠圖像處理軟件，讀取Notch1/β-actin、Jagged1/β-actin灰度值比值進行半定量檢測。

統計學分析：采用SPSS17．0統計軟件包進行統計學處理，數據以均數±標準差(x±s)或百分率表示，率的比較采用χ2檢驗，Fisher確切概率法;多個樣本均數比較采用方差分析，多重比較用LSD-t檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

結果

1Notch1基因的表達情況

Notch1基因陽性率:ALL組顯著高于對照組，差異有統計學意義(P＜0．05);AML組顯著高于對照組，差異有統計學意義(P＜0．05);ALL組與AML組比較差異無統計學意義(P＞0．05)。見表2。Notch1基因表達水平:ALL組及AML組與對照組比較差異均無統計學意義(P＞0．05);ALL組與AML組比較，差異亦無統計學意義(P＞0．05)。見表2，圖1。ALL組32例患兒中，Notch1基因陽性23例。其中B-ALL組26例，陽性17例(65%);T-ALL組6例，陽性6例(100%)，組間比較差異無統計學意義(P＞0．05)。T-ALL組與B-ALL組Notch1基因表達分別為1．42±0．58和0．71±0．27，組間比較差異有統計學意義(t=3．835，P=0．001)。

2Jagged1基因的表達情況

ALL、AML及對照組3組間Jagged1基因陽性率比較差異無統計學意義(P＞0．05)。ALL組及AML組Jagged1基因表達水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0．05)。ALL組與AML組比較差異無統計學意義(P＞0．05)。見表3，圖2。ALL組32例患兒中，Jagged1基因陽性25例。其中B-ALL組26例，陽性21例(81%);T-ALL組6例，陽性4例(67%)，組間比較差異無統計學意義(P＞0．05)。T-ALL組與B-ALL組Jagged1基因表達分別為0．72±0．29和0．70±0．31，組間比較差異無統計學意義(t=0．127，P＞0．05)。

3Notch1和Jagged1基因在骨髓及外周血中的表達水平比較

在發病初期同時收集骨髓及外周血的9例患兒，進行骨髓和外周血中基因表達水平的半定量比較。Notch1基因在骨髓和外周血中的平均表達水平分別為0．79±0．24和0．77±0．23，差異無統計學意義(t=0．1460，P＞0．05)。Jagged1基因在骨髓和外周血中的平均表達水平分別為0．75±0．19和0．74±0．20，差異無統計學意義(t=0．1140，P＞0．05)。

4Notch1與ALL臨床分型的關系

32例ALL患兒中，低危組Notch1陽性表達率為50%(5/10)，中危組為71%(10/14)，高危組為88%(7/8)。不同臨床分型的3組間Notch1基因陽性表達率差異無統計學意義。

討論

Notch基因最早發現于果蠅，該基因的部分功能缺失導致果蠅出現翅緣缺刻(Notch)。在脊椎動物中，共發現4個Notch同源體，Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。在哺乳動物中有5種Notch配體，Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4、Jagged1和Jagged2。Mummery-Widmer等［6］研究發現了參與非對稱細胞分裂的6個新基因及調控Notch信號通道的23個新基因。Notch信號通路是進化過程中高度保守的信號轉導通路，調控細胞增殖、分化與凋亡的功能，幾乎涉及所有的組織和器官。在血液系統中，Notch受體及其配體在造血細胞增殖、分化過程中具有極為重要的作用。Notch還可促使造血干細胞向T細胞方向分化，并促進外周T細胞和脾邊緣區B細胞的分化與成熟［7］。Notch信號在人類各種腫瘤中廣泛表達。在腫瘤發生的過程中，Notch受體可能扮演致癌基因與抑癌基因的雙重角色，這與組織類型、腫瘤發展階段及Notch信號強度有關。

Notch信號通路與惡性腫瘤的關系最早在人類T-ALL中被發現［2］。在T-ALL中，普遍存在Notch信號的活化和Notch基因的高表達。Notch1～4的失調均與T淋巴細胞惡性疾患有關。Chiaramonte等［8］通過對34例白血病患者的外周血和25個白血病/淋巴瘤細胞系的研究發現，T細胞惡性腫瘤幾乎都有Notch信號通路的活化。本研究發現，Notch1在兒童不同類型AL中的異常表達有明顯差異，T-ALL發病與異常的Notch1信號通路有關。與正常對照相比，在ALL及AML患兒中，Notch1陽性表達率增高，并且差異具有統計學意義，而ALL和AML比較，差異無統計學意義，提示Notch1信號可能在AML中也起著重要作用。王冠玲等［9］應用免疫組化的方法研究了11例AML患兒，發現Notch1蛋白陽性表達率較高，考慮Notch1信號可能在粒系來源的髓性白血病中也起著重要作用。

Notch信號與B淋巴細胞惡性疾患密切相關。Jundt等［10］在霍奇金病的惡性B細胞中檢測到Notch1受體高表達，與配體結合后，Notch1信號通路激活，促進轉化B細胞生長，抑制亞砷酸導致的細胞凋亡。Wickremasinghe等［11］最近發現，Notch高表達可以抑制p53介導的細胞凋亡，導致慢性淋巴細胞白血病(CLL)細胞凋亡的發生，而阻斷Notch信號后，p53表達水平升高并啟動凋亡程序促使腫瘤消退。本研究對表達陽性的患兒進行半定量分析，Notch1在T-ALL中明顯高表達，而在B-ALL中表達水平較低，二者差異有統計學意義。6例T-ALLNotch1基因全部表達陽性，而26例B-ALL中17例表達陽性，但差異無統計學意義，考慮可能與T-ALL病例數偏少有關。

AML源自造血祖細胞的失調，其特征為過度的自我更新和分化受阻。Tohda等［12］報道AML細胞系及病人AML細胞均有Notch1表達，因此研究推測Notch信號可能與AML細胞的異常生長有關，但進一步的研究卻不支持該假設。Tohda等［13］檢測了人類重組Notch配體Jag-ged1及Delta1對原發AML細胞生長和分化的影響，結果顯示對短期生長的影響有3種:促進、抑制和無顯著影響，而自我更新能力受到抑制或無顯著影響。本研究對47例AL兒童中ALL組、AML組、對照組Jagged1陽性表達進行比較，發現各組間差異無統計學意義。Chiaramonte等［14］研究發現Jag-ged1在B-ALL、T-ALL、AML表達水平依次增高。周亞南等［15］報道，Jagged1表達趨勢與Chiaramonte的研究一致但均低于正常供體。本研究驗證了兩者的共同點，但本研究結果顯示，ALL、AML患兒Jag-ged1基因表達水平均比對照組高，而B-ALL組與T-ALL組比較差異無統計學意義。原發AML盡管Notch1信號活化水平較低，卻有著Jagged1的高水平表達，Jagged1可能本身十分重要，不一定要與Notch信號通路激活有關，在髓系白血病發病過程中可能存在Jagged1信號自主活動。2009年，Tohda等［16］進一步研究發現，在AML細胞系中，配體活化的Notch信號對不同的細胞存在不同的調控反應，即活化的Notch通路促進了TMD7細胞增殖，抑制了U937細胞的分化及凋亡，在OCI/AML-6和THP1細胞，Notch信號抑制了細胞生長和自我更新，誘導細胞向類巨噬細胞分化。

本研究對9例在發病初期同時采集外周血與骨髓標本的初發AL兒童進行Notch1及Jagged1mRNA半定量檢測，發現外周血單個核細胞中Notch1及Jagged1基因表達水平與骨髓液中單個核細胞中Notch1及Jagged1基因表達水平一致，差異無統計學意義。提示可用外周血替代骨髓液進行Notch1及Jagged1基因檢測，而且可以減少AL兒童因骨髓穿刺造成的身體及心理傷害。不同類型ALL中的表達有明顯差異，T-ALL患兒中的Notch1表達明顯高于B-ALL患兒;在兒童AL細胞中，普遍存在Notch1信號的活化;Notch1在兒童AML中異常表達，提示Notch1在兒童AML中也起著重要作用。Jagged1在ALL及AML患兒中異常表達，還需要收集更多資料論證。