重金屬鉬離子免疫學(xué)研究
          
						
						
						
						
						
          
						
						
					
          					
					 
           
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          重金屬鉬離子免疫學(xué)研究
           
          一、結(jié)果與分析
           
          1.細(xì)胞融合備用小鼠的效價(jià)與敏感性結(jié)果免疫小鼠血清抗體效價(jià)均達(dá)到1∶104，說(shuō)明獲得較好的免疫效果，其中3號(hào)小鼠效價(jià)最高為1∶（5．12×104）。以Mo6＋在3．906～1　000μg／L時(shí)與過(guò)量EDTA鰲合后形成的鰲合物為抑制劑，5只小鼠的抗血清均產(chǎn)生了抑制。其中3號(hào)小鼠抑制效果最好，將其A450值轉(zhuǎn)化為B／B0，以B／B0為y軸，以Lg［Mo6＋－EDTA］為x軸，再對(duì)Lg［Mo6＋－EDTA］進(jìn)行回歸分析，3號(hào)小鼠的線性回歸方程為y＝－32．185x＋96．364，r為0．977　1，IC50為27．57μg／L。3號(hào)小鼠的抑制曲線見(jiàn)圖1。
           
          2.Mo6＋－EDTA　mAb雜交瘤細(xì)胞株的建立雜交瘤細(xì)胞株的篩選：細(xì)胞融合10d后觀察融合效果，4塊細(xì)胞培養(yǎng)板384孔中有雜交瘤克隆形成的有375孔，融合率為97．6％；同時(shí)進(jìn)行間接ELISA和阻斷ELISA檢測(cè)，陽(yáng)性48孔，陽(yáng)性率為14．7％；3次亞克隆后獲得4株雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1E3、2D7、2F10、4B3。雜交瘤核型鑒定：NS0染色體數(shù)目為62～68條，小鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)目為40條，本試驗(yàn)獲得的4株雜交瘤染色體數(shù)目分別為98．3條、99．32條、98．1條、102條，平均99．4條，高于兩個(gè)親本的染色體數(shù)目，說(shuō)明4株雜交瘤確實(shí)是兩親本細(xì)胞融合后的雜交體。雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果：4株雜交瘤凍存前細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)與凍存15d、30d、60d復(fù)蘇培養(yǎng)后上清效價(jià)基本一致，說(shuō)明4株雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性良好。
           
          3.Mo6＋－EDTA－mAb的免疫學(xué)特性鑒定效價(jià)測(cè)定　篩選出4株雜交瘤細(xì)胞，其中4B3株抗體效價(jià)最高，細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為1∶（3．6×102），腹水效價(jià)為1∶（5．12×105）。敏感性測(cè)定　敏感性結(jié)果見(jiàn)表1，4株雜交瘤細(xì)胞株抑制曲線。4株雜交瘤細(xì)胞株均獲得較好的敏感性。4株雜交瘤細(xì)胞的Mo6＋－EDTA－mAb對(duì)Mo6＋－EDTA均具有較高的敏感性；其中4B3細(xì)胞株的敏感性最高。特異性鑒定　4B3雜交瘤細(xì)胞的mAb的交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果可知，4B3雜交瘤細(xì)胞的mAb對(duì)Mo6＋－EDTA的IC50為23．4μg／L，對(duì)Cr3＋－EDTA的IC50為28．59μg／L，具有較高交叉反應(yīng)率；與其他金屬離子螯合物交叉反應(yīng)性較低可忽略不計(jì)。
           
          二、討論
           
          1.Mo6＋－EDTA－pAb的免疫學(xué)特性鑒定抗體的免疫學(xué)特性主要體現(xiàn)于抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合容量、親和性和選擇性3個(gè)方面。結(jié)合容量大小以效價(jià)來(lái)衡量，本試驗(yàn)采用間接ELISA測(cè)定其效價(jià)，免疫動(dòng)物后均獲得較高的效價(jià)，效價(jià)最高達(dá)到1∶（5．12×104）。由于pAb為異源性抗體，其親和性不均一，測(cè)得Ka值的準(zhǔn)確性不高，所以本試驗(yàn)親和性得檢測(cè)用敏感度來(lái)衡量，敏感度是由抗原抗體反應(yīng)的親和性決定的，用IC50值計(jì)算靈敏度，代表標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)抗原抗體結(jié)合50％是的抑制質(zhì)量濃度，IC50值越小，靈敏度越高。本試驗(yàn)中2號(hào)鼠產(chǎn)生的pAb的IC50值為37．94μg／L，在免疫鼠中最低，親和性最好。本研究采用交叉反應(yīng)試驗(yàn)鑒定其特異性，結(jié)果表明免疫鼠產(chǎn)生的Mo6＋－EDTA　pAb均具有較高的特異性。
           
          2.雜交瘤細(xì)胞株的篩選方法制備高質(zhì)量的mAb需要建立可靠的雜交瘤細(xì)胞篩選體系，一般有3條要求，一是準(zhǔn)確測(cè)定上清效價(jià)，二是能夠避免橋抗體的產(chǎn)生，三是確定mAb的特異性。本試驗(yàn)同時(shí)采用間接ELISA和阻斷ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤，以Mo6＋－ITCBE－OVA作為包被原采用間接ELISA法測(cè)定上清效價(jià)，Mo6＋－EDTA作為標(biāo)準(zhǔn)品采用阻斷ELISA法確定陽(yáng)性雜交瘤，可以簡(jiǎn)便地篩選出效價(jià)高、無(wú)橋抗體、特異性強(qiáng)的Mo6＋螯合物雜交瘤細(xì)胞株。本試驗(yàn)所制備Mo6＋－EDTA－mAb為高親和力抗體。
           
          3.關(guān)于交叉反應(yīng)性mAb的交叉反應(yīng)性表示mAb與競(jìng)爭(zhēng)物結(jié)合的結(jié)構(gòu)特異性，是揭示參與反應(yīng)混合物與其交叉結(jié)合的重要化學(xué)參數(shù)。本試驗(yàn)所制備的Mo6＋－EDTA　mAb除與Cr3＋－EDTA有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)性外，與其他金屬螯合物和EDTA無(wú)交叉反應(yīng)；Khosraviani　M等建立的水樣中Cd2＋間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，也與Hg2＋具有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)；王建華等所建立的鉬離子多克隆抗體ELISA競(jìng)爭(zhēng)法，也表現(xiàn)出與汞離子有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)。Jones　R　B等采用距離矩陣法（distancematrix，DM）比較不同金屬－螯合劑復(fù)合物分子三維結(jié)構(gòu)的差異，發(fā)現(xiàn)Cd2＋－EDTA與Hg2＋－EDTA的三維結(jié)構(gòu)差異最小，認(rèn)為這可能是抗體對(duì)Hg2＋產(chǎn)生交叉反應(yīng)的主要原因。Love　R　A等認(rèn)為，螯合劑與金屬離子通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)合而使螯合劑的構(gòu)型發(fā)生改變，螯合劑結(jié)合不同金屬離子具有不同的構(gòu)型，螯合劑的構(gòu)型是決定抗原抗體識(shí)別的重要因素。本試驗(yàn)中Mo6＋－EDTA與Cr3＋－EDTA親和性高，可能是鉬鉻在同一副族，離子半徑相近，原子結(jié)構(gòu)相似，化學(xué)性質(zhì)接近的原因。
           
          作者：范國(guó)英 王自良 姜金慶 黃華國(guó) 張海棠 丁菡 李藝