電化學DNA傳感器的運用
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電化學DNA傳感器主要由表面固定了ssD-NA(單鏈DNA)[4]探針的電極金電極、玻璃電極和碳糊電極等)和檢測用的電化學雜交指示劑(即標識物)兩部分構成(如圖1所示)。為了提高雜交的專一性,ssDN段長度范圍一般從十幾個堿基到幾十個堿基,通常采用人工合成的短鏈寡聚脫氧核苷酸,其堿基序列與樣品中的靶序列互補。在適當的溫度、pH和離子強度條件下,固定在電極上的ssDNA與雜交緩沖溶液中的靶基因發生選擇性雜交反應。如果樣品中含有完全互補的DN段則在電極表面形成dsDNA(雙鏈DNA),從而引起電極上電流值的變化,利用微分脈沖或循環伏安法可檢測出dsDNA雜交信號。電化學雜交指示劑是一類能與ssDNA和dsDNA以不同方式相互作用的電活性化合物,其電活性可使檢測時的測量電流增大,提高檢測靈敏度,但電化學雜交指示劑的加入使電化學信號的本底加大,使檢測的分辨率降低。提高電極上ssDNA探針的靈敏度,一方面與雜交指示劑對dsDNA和ssDNA的選擇性結合能力的差異有關,另一方面與電極表面特異性吸附有關[5]。目前選用的嵌合劑均為單嵌合劑,可以考慮選用雙嵌合劑和三嵌合劑。利用其“分子剪刀”的功能,改善其靈敏度和選擇性。選用磷酸緩沖底液進行檢測,可避免對指示劑的非特性吸附[6]。在基因檢測方面采用計時電勢信號轉換模式(PSA)檢測,比伏安法靈敏度高,并能獲得有效的背景補償,可在5~20min短時間內檢測納克(ng)的目標DNA序列[7]。采用光刻沉積技術制備的金膜作為傳感電極[8],與巰基修飾的寡核苷酸探針自組裝成的電化學核酸傳感器,濃度檢測線性范圍為1.5~50nmol/L。以肽核酸[9](PNA)代替ssDNA作為探針分子修飾到電極表面,電極表面上的PNA仍能保持其在溶液中專一和有效的雜交特性,PNA識別層使傳感器具有更高的靈敏度和專一性,雜交速度快,并且不受離子強度的影響。
2電化學DNA傳感器的分類
DNA修飾電極是電化學DNA傳感器的重要部分,該類傳感器也多以此進行分類。ssDNA修飾(或固定)到電極上的方法,現有的文獻報道主要集中在自組裝膜法、吸附結合法、表面富集法、共價鍵結合法、化學免疫法、組合法、生物素-親和素反應法和LB膜法等。本文主要敘述以下幾種:
2.1吸附結合法
該方法是將碳糊電極放到含DNA探針分子的乙酸緩沖溶液中在一定電位下活化電極,然后在控制電位下吸附富集探針分子,最后用磷酸緩沖溶液淋洗后便可使用。其特點是簡單、靈活,但穩定性不夠。Pang[3,10]等研究證明,ssDNA在汞電極上的吸附性質為化學吸附,生成吸附化學鍵,質子化的ssDNA分子通過嘌呤和嘧啶堿基上芳香雜環的π鍵鍵合而吸附到汞電極上。Hashimoto[11,12]等采用吸附法在平面熱解石墨電極上固定了DN段。他們[12]還通過化學吸附在金電極表面修飾了20mer的DNA探針,該探針與v-myc基因部分互補。Wang等[13]利用電化學富集方法將DNA修飾到碳糊電極(CPE)上,制成DNA探針修飾電極。
2.2自組裝膜法
即基于分子的自組作用,在固體表面自然形成高度有序的單分子層膜的方法。在DNA技術中,一般是利用帶巰基(—SH)的化合物在金電極表面上可以形成自組裝單分子膜的特性來固定核酸。其特點是表面結構高度有序,穩定性好,有利于雜交;但對巰基化合物修飾的DNA的純度要求較高,分離提純操作較煩瑣。白燕[14]等人利用自組裝單分子膜技術,考察了ssDNA/Au電極、dsDNA/Au電極的指示劑氧化峰電流。研究表明,ssDNA/Au電極、dsDNA/Au電極的指示劑氧化峰電流響應值之差與互補DNA濃度在一定范圍內呈線性關系,據此可以識別特定序列的DNA,并對其進行定量。陸琪[15]等人采用先進行—SH化合物自組裝,得到自組裝單分子層,再在其上共價鍵合或吸附固定DNA的方法,制備DNA修飾電極,克服了由于—SH修飾的DNA難以合成,并且需要分離提純,操作繁瑣的缺點。Xu[16]等先將4_巰基丁基膦酸(MBPA)在純乙醇中固定到硅晶片的金膜上,然后再與Al3+反應,形成一層包含Al3+的膜,再通過Al3+與DNA之間的靜電作用將ssDNA固定到電極上。
2.3共價鍵結合法
該法首先對電極進行活化預處理,以引入活性鍵合基團,然后進行表面的有機合成,通過共價鍵合反應把探針分子修飾到電極表面。如在氧化的玻碳電極表面,以一種水溶液的乙基_(3_二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸和N_羥基磺基琥珀酰亞胺作為偶聯活化劑,小牛胸腺DNA和多聚脫氧鳥苷酸、多聚脫氧胞苷酸片段通過與活化的電極表面(O_酰基異脲)形成磷酰胺鍵共價結合到電極表面。其特點是修飾層穩定,易進行分子雜交,但由于電極表面活性位點有限,表面合成又是異相反應,因而固定的DNA量有限,響應信號小。S.Lin[17~19]采用共價鍵法,成功地在石墨電極上固定了DNA探針。趙元弟等[20]采用巰基化合物自組裝/共價鍵合反應的逐層固定方法,將雙鏈DNA固定到金電極表面,得到DNA修飾電極,并對該電極表面進行了電化學和X射線光電子能譜表征,研究了電極表面固定化小牛胸腺DNA和一種具有10堿基長度的寡聚核苷酸探針分別與溶液中DNA的表面分子雜交情況。
2.4化學免疫法
在免疫傳感器的研究及應用方面,本課題組研究了多種Nafion膜修飾微鉑電極對溶液中NO的電化學行為進行了研究[21~24],并用自行設計合成的大環鎳制成了Nafion膜修飾電極,實現了對多巴胺和腎上腺素這兩種哺乳動物的重要神經遞質的同時測定[25];用PVC膜修飾的免疫電極采用流動注射分析了乙肝抗原[26];通過戊二醛偶聯乙肝表面抗體(抗-HBs),用自組裝的硫脲單分子層金免疫電極,檢測了乙肝表面抗原[27]。采用了溶膠-凝膠(sol-gel)技術,成功將乙肝表面抗體(HBsAb)包埋于sol-gel中,此方法可用于檢測乙肝表面抗原HBsAg[28]。同時結合溶膠-凝膠(sol-gel)和交聯技術,將乳腺癌抗體固定在鉑盤電極表面的氨基化sol-gel功能膜上,用于檢測乳腺癌抗原(CA15-3)的免疫傳感器[29]等。利用化學免疫法固定DNA首先在電極表面鍵合抗生蛋白(avidin),然后利用抗生蛋白與生物素之間的親和作用,使其與5′端標記有生物素(biotin)的DNA結合,因而將DNA固定于電極表面。Yoshio[30]利用avidin與biotin的基本反應通過多層分子組裝將dsDN段固定化,用以測定相對分子質量小的有機物質和氯代聯苯、氯代酚、雙酚A、溴化乙啶等。
2.5組合法
該法是將化學修飾劑與電極材料混合以制備組合修飾電極。Millan[31]將18_烷基胺或18_烷基酸混入碳糊中,得到修飾的碳糊電極。在DEC存在下,18_烷基胺的氨基與ssDNA5′末端的磷酸基形成磷酰氨鍵,并將其固定在電極上。
3電化學DNA傳感器中的標示物
DNA傳感器對目標基因的選擇性識別是靠核酸的雜交來完成的。為了檢測所發生的雜交信息,必須采用一種電活性物質來指示,即電化學DNA傳感器的標示物。本文主要介紹以下3種標示物。
3.1具有電化學活性的雜交指示劑作為標示物
許多具有電化學活性的小分子物質能與DNA分子發生可逆性相互作用,其中一些物質能夠專一性地嵌入dsDNA分子雙螺旋結構的堿基對之間,這一類物質稱為雜交指示劑。在雜交過程中雜交指示劑與電極表面的dsDNA形成復合物,根據雜交指示劑與ssDNA和dsDNA結合方式和結合能力的差異,通過測定其氧化還原峰電流和峰電位可以識別和測定DNA分子。能夠選擇性識別ssDNA和dsDNA而又不與DNA鏈發生不可逆的共價結合,同時又能給出電流或電勢識別信號的雜交指示劑是該類電化學DNA生物傳感器的關鍵。指示劑與DNA的結合方式主要有:(1)與DNA分子的帶負電荷的核糖/磷酸骨架之間的靜電作用;(2)與DNA溝槽的嵌入作用。雜交指示劑對dsDNA比對ssDNA有更高的特異性結合能力,這樣才能指示靈敏。一般地說,dsDNA與指示劑的相互作用為靜電作用和內部疏水性作用,而ssDNA主要是靜電作用,可以從其電化學峰電位的移動來判斷,前者峰電位正移,后者峰電位負移[32]。Wang[33,34]等用肌苷代替DNA探針中的鳥嘌呤來消除探針中鳥嘌呤的氧化峰,然后利用探針和靶序列,對雜交后出現的鳥嘌呤的氧化峰進行檢測。Hashimoto[35]等利用多種雜交指示劑進行電化學基因檢測,發現電活性小分子道諾霉素(daunomycine)可以通過峰電位的移動,很好地區分dsDNA和ssDNA,并且其電流密度相當高,在10μmol/L的溶液中達到6.5μA/c,可檢測到10-8g/mL的靶基因序列。Hoechst33258能專一性地作用于雙螺旋DNA的小溝槽的A-T堿基對,可以通過其陽極峰電流的變化來指示。而其它的指示劑,如丫啶黃(acridineorange)、米諾霉素(minocycline)、普匹碘銨(propidiumiodide)等,效果就不如前二者。
3.2寡聚核苷酸上修飾電化學活性的官能團作為標示物[2,3]
合成帶有電化學活性基團的寡聚核苷酸與電極表面的靶基因選擇性地進行雜交反應,在電極表面形成帶有電活性官能團的雜交分子,通過測定其電信號可以識別和測定DNA分子。Takenka等人[2]成功地在寡聚核苷酸的5′端磷酸基上標記具有電化學活性的羧基二茂鐵制成二茂鐵寡聚核苷酸,合成的二茂鐵寡聚核苷酸選擇性地與互補單鏈DNA形成復合物,采用電流檢測,檢測信號與復合物的量呈線性關系。
3.3利用酶的化學放大功能在DNA分子上標記酶作為標示物[2,3]
當標記了酶的ssDNA與電極表面的互補ssDNA發生雜交反應后,相當于在電極表面修飾了一層酶,酶具有很強的催化功能,通過測定反應生成物的變化量可以間接測定DNA。
4電化學DNA傳感器的醫學應用
4.1在細茵及病毒感染類疾病診斷
細菌及病毒感染是引起人類疾病的主要原因之一。歷史上許多災難性的瘟疫,如霍亂、天花、麻疹等,都是由相應的病菌或病毒所引起的,因此盡早診斷出病源微生物(細菌或病毒)的感染,是預防這類疾病的關鍵[1,36]。Wang[37]等人用陽極氧化法,將與結核桿菌(Mycobateriatuberculosis)基因DR區相對應的兩個長度分別為27和36堿基的DNA探針,固定在碳糊電極表面,制成電化學DNA傳感器。利用計時電位分析法,以Co(Phen)33+作指示劑,進行了DNA傳感器用于結核桿菌診斷的最初嘗試。武漢病毒研究所用化學免疫法固定乙型肝炎病毒(HBV)的DNA探針,用來與牛腸磷酸酶(CAP)標記的互補探針雜交,利用光動力計測量雜交帶入的CAP釋放出的光強度,驗證了DNA傳感器進行HBV診斷的可行性[38]。日本的Hashimoto等人[39]將巰基標記的HBV探針自組裝在金和鈦電極表面,用電化學方法檢測了血清HBVDNA的競爭性PCR擴增產物,結果表明用DNA傳感器HBV的臨床診斷,不受血清中其它DNA成分的干擾,具有良好的特異性。近來,吳少慧等人[40]通過陽極氧化法,將HBV的DNA探針固定在鍍金的石英晶體表面,組裝成石英晶體傳感器[41~44]。用該石英晶體傳感器去檢測HBV的DNA時,作為檢測對象的DNA會與固定在石英晶體表面的DNA探針雜交,引起石英晶體的質量改變,從而使石英晶體的振蕩頻率改變,產生檢測信號。用該傳感器檢測了6個HBV血清,證明其穩定性能滿足臨床HBV的診斷要求。
4.2基因診斷
基因遺傳病是當前威脅人類健康的天敵,許多基因遺傳病至今還沒有根治的方法,因此,基因診斷變得越來越重要,尤其對遺傳性疾病的產前和病前診斷顯得更為重要,而在基因與功能的研究以及其他許多方面,DNA序列分析均是必須完成的關鍵步驟,利用電化學DNA傳感器測定DNA序列效果較好。Millan等[31]在ssDNA修飾了碳糊電極,在較高離子強度下與靶基因快速雜交(<10min),用該傳感器測定了18個堿基長度的囊性纖維變性基因ΔF508序列,得到了令人滿意的結果。Wang等[7]報道了艾滋病人類免疫缺陷病毒型(HIV-Ⅰ)相關的短DNA序列測定的傳感器。他們將21和24個堿基與HIV-IU5LTR序列互補的單鏈寡核苷酸部分修飾在碳糊電極(CPE)上,以雜交指示劑Co(Phen)33+溶出峰來檢測雜交。靶基因片段檢出限為4×l0-9mol/L。Wang等[33]提出了以肽核酸(PNA)代替ssDNA作為探針修飾到電極表面,己證明PNA與互補核苷酸有很多的雜交特性,在許多方面顯示出優于ssDNA的性能,有望被很好地用于基因診斷。
4.3藥物分析
許多藥物與核酸之間存在可逆作用,而且核酸是當代新藥發展的首選目標。電化學DNA生物傳感器除了可用于特定基因的檢測外,還可用于一些DNA結合藥物的檢測以及新型藥物分子的設計[32]。Wang等人[45]將修飾dsDNA的碳糊電極插入吩噻類藥物的醋酸緩沖溶液中富集,進行計時電位分析。結果發現,在未修飾dsDNA的碳糊電極上,吩噻僅僅產生非常小的陽極峰,而在修飾電極上可以測得nmol/L級吩噻類藥物。羅濟文等人[46]研究了道諾霉素(DNM)在小牛胸腺DNA修飾石墨粉末微電極上的電化學行為,提出了測定微量DNM的方法,DNM濃度在1.0×10-7~1.0×10-5mol/L之間,其微分脈沖伏安(DPV)峰電流與濃度有良好的線性關系,檢出限為5.0×10-8mol/L,并以此為基礎提出了一種測定人尿中痕量DNM的方法。該方法簡單、快速、靈敏度較高。宋玉民等[47]用電化學方法和熒光方法研究了桑色素(Morin)和抗腫瘤活性較強的桑色素合銅(Ⅱ)、桑色素合鋅(Ⅱ)與DNA在生理條件下的相互作用,從分子水平探討桑色素及其配合物抗癌活性不同的存因以及DNA作用方式之間的聯系。Maeda等人[48]研究了抗瘧藥阿的平在DNA修飾電極上的電化學檢測。結果顯示,在1×10-7~5×10-7mol/L范圍內,阿的平的濃度與指示化合物鐵氰化鉀的陽極峰電流成正比,當濃度在8×10-7mol/L時達到飽和。同時,用NaCl溶液做對比實驗,證實阿的平與DNA分子發生了強烈的特異性相互作用。這為今后研究某些藥物與DNA的相互作用機理及建立簡便的藥物篩選方法作了探索性的工作。
4.4DNA損傷研究
人類基因與其它物種基因的功能均是編碼遺傳信息從而保護其完整性[49]。DNA修復酶始終監視染色體并修復基因和細胞化學物所致的核苷酸殘基的破壞,若沒有DNA修復,那么由多種多樣的DNA損傷因素所引起的染色體不穩定性將對細胞和生物體產生致命的影響[50~53]。利用電化學DNA傳感器對DNA損傷進行測定取得了令人滿意的效果。孫星炎等[54]研究了不同致突變因素(紫外光照射、亞硝酸)的作用下,以石墨電極為基底電極,特定堿基序列的DNA在電極表面能否雜交及雜交程度的差異,對DNA突變情況及可能的突變機理進行了探討。Wang等[55]直接固定dsDNA微型電化學傳感器,探討紫外光輻射引起的DNA中鳥嘌呤氧化峰信號的變化,來檢測DNA的損傷。Sue等[56]認為,目前基因檢測在疾病診斷方面的原理,一般是用固定的抗原或抗體來探察和它們捆綁在一起的分子聚集時的生物流動性,而電化學DNA生物傳感器的微排列,是由數千被合成或被克隆的能在樣品中被察覺的連續互補DNA序列組成,臨床上通過傳感器的檢測能夠迅速找出哪種組織患病和是否帶有耐藥因子,為疾病的快速診斷提供了可能。
5展望
電化學DNA傳感器具有重要的理論意義和應用價值。它開辟了電化學與分子生物學交叉學科的新領域[57,58,60]。為生命科學的研究提供了一種新技術、新方法。在臨床醫學和遺傳工程等領域的研究具有深遠的意義和應用價值。今后電化學DNA傳感器的研究工作將會集中在:(1)適于高靈敏度檢測的雜交指示劑的篩選研究;(2)電極結構的優化,穩定的自組裝單分子層修飾電極在電化學DNA傳感器的研究;(3)電化學DNA傳感器在疾病基因診斷上的應用;(4)將一些藥物作為雜交指示劑,研究其與DNA的相互作用。
