生物醫學中NO探究

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1NO的生物化學

NO是一種難溶于水、高脂溶性的小分子氣體,極易通過細胞膜擴散。它擁有額外電子,化學反應能力強,生物學半衰期為3～5s。體內NO是由NO合成酶(nitricoxidesynthase,NOS)催化L-精氨酸(L-Arg)轉變為L-瓜氨酸時產生的。NO在多種細胞中均能生成,生成后很快被氧化成NO2-和NO3-,從而失去生物學活性。NOS是NO反應通路的限速酶,根據其來源及作用特點,可分為神經元型(nNOS)、內皮型(eNOS)和誘導型(iNOS)3種;根據其被提純順序及克隆結果,又可分為3種同工酶,即同工酶Ⅰ(nNOS)、同工酶Ⅱ(iNOS)、同工酶Ⅲ(eNOS)。nNOS與eNOS在體內可連續表達,通過Ca2+內流及鈣調蛋白(CaM)激活,激活后產生短時效少量的NO;而iNOS則需要α-腫瘤壞死因子(TNF-α)、γ-干擾素(INF-γ)、白細胞介素1(IL-1)、細胞脂多糖(LPS)等誘導才表達,產生局部高濃度的NO而介導后繼的長效反應[1]。一般認為,iNOS的激活不依賴于Ca2+/CaM,但目前3種NOS在Ca2+/CaM依賴性上的區別日趨模糊。

NOS的C端與細胞色素P-450還原酶有共同序列[2],具有顯著同源性。3種同工酶是不同的基因產物,種屬間NOS氨基酸序列具有高度保守性,人類各同工酶之間序列同源性為50%～60%,而不同種屬動物間相同同工酶序列同源性大于90%。目前3種同工酶的cDNA結構已被克隆和表達。所表達的3類NOS的N端結構極其相似,可能與其L-Arg結合位點和催化活性有關。利用特異性DNA探針已經證明,人NOS3種同工酶基因分別位于12號、17號和7號染色體,它們的基因結構已部分搞清,對基因中某些結構區域的功能也有了一定了解。通過某些細胞因子、酶類、Ca2+/CaM及激素等調控因子對NOS基因表達影響的研究,闡明了mRNA穩定性是NOS活性的重要調節點[3],而且NO能反饋抑制NOS的活性。NO的作用靶是鳥苷酸環化酶(GC)。NO與含血紅素的GC上Fe2+結合,激活后的GC導致cGMP水平增加,cGMP再作用于cGMP依賴的蛋白激酶及磷酸二酯酶,調節離子通道,使有關遞質釋放而發揮生理效應。NO激活的GC可使cGMP生成速度加快50～200倍。NO和GC的結合代表著一種新的廣泛存在的將細胞外信息轉導為鄰近細胞內cGMP的信息傳遞機制。NO對腺苷二磷酸(ADP)核苷基轉移酶也有作用。此酶可將ADP的核苷基團轉移至線粒體蛋白與線粒體中酶蛋白的羧基上,使蛋白構象改變而發揮作用。影響NO生物作用的主要因素是NO的生物半衰期。另有報道,NO能降低細胞內的游離Ca2+濃度,從而防止細胞內Ca2+濃度過高,保護細胞;反過來,NO生成又依賴于細胞內游離Ca2+,Ca2+對維持NOS活性是必需的。

2NO對機體主要系統的作用

2.1NO對心腦血管系統的作用NO是血管平滑肌擴張劑,可使血管舒張,血壓下降。正常情況下,血管內皮細胞和心內膜釋放少量的NO,維持適度的血流、血壓和腦血管屏障通透性。NO通過cGMP抑制血小板的凝集和粘附,發揮內源性抗血栓作用。NO是血管內環境穩定的重要分子,異常的NO生物利用度與許多血管疾病有關[4]。在病理情況下,NO釋放減少,內皮素增加,可導致血管舒縮功能調節失調、血小板凝聚和內皮細胞增殖,引起一系列心血管疾病,如高血壓、血管痙攣、高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化性心臟病等。低濃度NO對充血性心衰、循環性休克、腦缺血、動脈粥樣硬化和高血壓等許多疾病有治療作用。臨床上應用的硝普鈉(SNP)、硝酸甘油等NO供體藥物,都具有舒血管作用,同時還有更重要的細胞保護效應。NO供體保護心肌的主要機制是降低過氧化物酶活性,減少超氧自由基,進而減少中性粒細胞粘附于內皮和保護內皮機能;另一方面,NO通過降低心肌對β-腎上腺素能刺激的反應性而使耗氧量減少[5]。NO供體對腦、內臟、腎等各種血管床缺血再灌及休克治療中的內皮功能保護也有特殊作用。

2.2NO對神經系統的作用NO是一種特殊的擴散性神經遞質,不貯存于突觸小泡內,既可作為突觸前遞質從神經末梢釋放;也可作為突觸后遞質,從突觸后膜釋放。在外周神經系統中,NO作為突觸前遞質從非腎上腺素能非膽堿能(NANC)神經元末梢釋放。NO除直接作用外,還通過調節乙酰膽堿、兒茶酚胺、興奮性和抑制性氨基酸、5-羥色胺、組織胺等神經遞質間接發揮作用[6]。NO與學習記憶關系密切。海馬中一些區域在重復刺激后可產生長時程突觸增強(LTP)效應,NO對維持LTP有重要作用。用SNP可使海馬突觸效應持續增強,而向海馬神經元注射NOS抑制劑NG-硝基-L-精氨酸(L-NNA)和用Hb結合NO都可阻斷LTP。從NO入手將為尋找新型促智藥及防治早老性癡呆病(AD)提供新思路。NO與痛覺傳導密切相關。給與NOS抑制劑L-N-硝基精氨甲酯(L-NAME)后,小鼠在福爾馬林足底注射法、熱板法和乙酸導致的扭體模型上,均表現出明顯且持久的抗傷害作用。但無炎癥并發的急性和慢性疼痛似乎不依賴于NO[7]。

NO在嗅覺、視覺、觸覺的感應傳導中也發揮作用。NO是陰莖勃起的主要遞質,能增強性功能。用NOS免疫組化技術,發現NOS選擇性地分布于支配大鼠陰莖平滑肌的神經元中。直接應用NO和L-Arg會產生如神經受刺激一樣的海綿體平滑肌松弛作用,而NOS抑制劑選擇性地抑制肌松弛。NO在中樞神經系統及其對某些神經遞質釋放的調節中有雙重作用。eNOS可舒張血管和增加腦血流而具有神經保護作用。nNOS活性增強可加劇神經元損傷。過量釋放的NO可誘發癲癇,導致腦損傷和記憶缺損。例如,AD病人的大腦海馬中NOS陽性神經元數明顯低于正常人。而帕金森氏綜合癥(PD)患者腦膠質細胞中iNOS的表達與神經元損傷相關,其大量生成的NO加劇了多巴胺(DA)神經傳導障礙。軍用神經毒毒劑梭曼對小鼠的毒性可被Arg增強,被L-NAME減弱,且有劑量反應關系,而且梭曼中毒后小鼠大腦、小腦、海馬中NOS活性增加[8]。

2.3NO對免疫系統的作用巨噬細胞、炎性中性粒細胞、組織中免疫細胞等被內毒素或T細胞激活,表達iN-OS的mRNA,生成的iNOS催化產生大量NO。內源性NO是巨噬細胞殺傷靶細胞的信使分子,它通過非特異性免疫機制對抗侵入機體的微生物和病原體。肺和肝是機體循環路徑中的主要免疫濾過器,其非特異性免疫功能依賴于NO。NO還具有免疫抑制作用,在植物血凝素刺激的淋巴細胞體外增殖反應中,從巨噬細胞產生的NO可抑制淋巴細胞增殖反應。許多細胞因子,如IL-1、IL-2、TNF和IFN以及某些細菌內毒素可以單獨或聯合激活巨噬細胞產生NO,即正向調節。而另一些細胞因子如TGF-β、IL-4、IL-10、巨噬細胞滅活因子等可抑制巨噬細胞產生NO,即負向調節。巨噬細胞產生的NO對某些細胞因子的產生也具有調節作用。由此可見,作為免疫調節因子,NO的產生受細胞因子嚴密調節,處于復雜的細胞因子網絡監視之中。

2.4NO對呼吸系統的作用NO可使氣管、支氣管平滑肌松弛。低濃度(5×10-6)吸入NO或霧化吸入釋放NO的復合物是強有力的支氣管擴張劑,可用于臨床治療支氣管哮喘等疾病。20×10-6的NO可有效預防成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)[9],且在一定濃度范圍內,濃度越高作用越明顯。急性肺損傷時,由于LPS及多種細胞因子的作用,iNOS被激活,血漿及呼出氣中NO濃度升高。多量的內源性NO有雙重作用,一方面通過血管平滑肌擴張、心肌收縮力下降、多種代謝酶功能紊亂等而具有損害作用;另一方面通過降低肺動脈壓、減少血小板粘附及白細胞出游等發揮有利作用。但吸入適量NO可選擇性降低肺動脈高壓,改善氧合作用,而對體循環無影響。在慢性支氣管炎中,NO生成也增多。目前,測量上呼吸道NO已成為一項新的診斷指標。另外,吸入NO對早產兒和新生兒ARDS的救治也有效。最近發現,NO是呼吸道上皮細胞離子通道的調節器,它在呼吸道疾病及其防御中發揮重要作用[10]。

2.5NO對消化系統的作用NO是胃腸道NANC神經主要的抑制性神經遞質之一,對食管收縮或舒張功能、食管括約肌功能及食管蠕動功能有調控作用。免疫組織化學發現,NOS分布在腸系膜神經叢、神經軸突和腸粘膜。NO對胃腸道粘膜具有重要保護作用,如局部胃粘膜應用NO溶液或硝酸甘油、SNP等,能減輕酒精引起的胃粘膜出血。臨床上治療胃潰瘍的藥物生胃酮,就是通過釋放NO而發揮對胃粘膜的保護作用的。應激性胃粘膜損傷時,粘膜血流量明顯下降,粘膜通透性增加,血漿及粘膜NO含量明顯升高,用L-NAME可明顯加重粘膜損傷,并阻抑應激所致的血漿及粘膜內NO含量升高,使粘膜血流量更趨下降,而L-Arg可逆轉L-NAME的作用[11]。nNOS和eNOS誘導產生的NO,主要通過胃粘膜血流、上皮細胞分泌和屏障功能,保持胃腸粘膜完整性;而iNOS誘導產生的NO與胃腸道組織損傷有關[12]。NO對肝細胞功能、肝臟毒性和肝硬化的血液動力學也起重要調節作用。

3NO與寄生蟲感染

NO在瘧原蟲感染中的作用比較復雜。NO一方面可殺傷瘧原蟲,對宿主起保護作用;另一方面過量生成的NO又對宿主產生毒副作用。肝細胞對瘧原蟲子孢子的殺傷作用是L-Arg依賴性的。在瘧原蟲裂體增殖期間,宿主免疫細胞可產生NO以殺傷裂殖子,L-Arg的拮抗劑能減弱這種殺傷作用。感染瘧原蟲的小鼠血漿內的NO2-水平明顯高于正常小鼠[13]。由于瘧原蟲誘導宿主細胞的NOS活性明顯升高,可引起腦微血管內皮細胞、巨噬細胞等產生大量NO,NO擴散到周圍神經元,從而干擾正常的神經傳導。用滅活的曼氏血吸蟲尾蚴接種于小鼠,其皮膚內iN-OS表達水平明顯升高。用NO合成抑制劑氨基胍處理小鼠,其對血吸蟲尾蚴感染的抵抗力明顯降低[14]。山羊感染肝片吸蟲第3周,血漿中的NO和TNF-α開始升高,它們作為炎性介質可能參與了肝片吸蟲對肝的損害過程。因為NO和TNF-α對寄生蟲也有抑殺作用,所以二者還與宿主抗肝片吸蟲的機制有關[15]。NO對細胞內克氏錐蟲有殺傷作用。應用NOS抑制劑NG-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA)后,NO生成減少,殺傷錐蟲作用減弱,錐蟲血癥發生率及動物死亡率均增加[16]。雞感染球蟲后,血漿NO2-水平明顯升高,但并不隨球蟲感染劑量的增加而增加,與蟲株毒力大小也無直接關系[17]。中國農業大學從1997年開始進行NO與球蟲感染關系研究,結果表明,雛雞感染柔嫩艾美耳球蟲或堆型艾美耳球蟲后,血漿NO2-水平均明顯升高。eNOS抑制劑L-NAME、L-NA和iNOS抑制劑L-AG均能降低感染球蟲雛雞血漿NO2-水平和NOS活性。

4NO與腫瘤

NO在腫瘤的發生、發展和轉移等過程中均起作用,但對于不同的腫瘤類型,隨時間、部位及局部濃度的不同,NO的作用也很復雜。肺腺癌組織中,總NOS活性比正常肺高。人卵巢腫瘤中有iNOS表達,且其活性與腫瘤的分化程度相關,高分化卵巢癌iNOS活性比中分化和低分化者高。慢性肝炎繼發肝癌(HCC)病人,血清中NO水平明顯高于非HCC者,也明顯高于肝硬化并發HCC者。而在乳腺癌中,NO的水平則低于正常。腫瘤中少量NO的產生可增加腫瘤血流量并促進血管新生,如轉染了NOS基因的人結腸癌細胞系,較其來源組織生長快且血管分化程度也高[18]。NO還可促進前列腺素PGE2的合成。PGE2有促進血管生成作用,同時可增強血管通透性,有利于腫瘤組織攝取營養。但NO在腫瘤起始及演進過程中的作用機制仍不甚清楚。NO具有殺瘤和抑制腫瘤轉移的效應。原發性肺癌病人的肺泡巨噬細胞由于iNOS活性增加,NO生成顯著高于對照組[19]?？ń槊?BCG)可用于膀胱癌的治療,但NOS抑制劑可拮抗BCG的療效。通過將iNOS轉染到轉移性黑色素瘤細胞,發現能極大地減少轉移,表明腫瘤細胞產生的NO可降低其轉移潛能。宿主細胞產生的NO也能通過阻止循環中的瘤細胞對血管內皮的粘附而抑制轉移,小膠質細胞分泌的NO可抑制腫瘤的腦部轉移。因此,通過轉染iNOS可能成為殺傷腫瘤細胞和控制腫瘤轉移的有效途徑[20]。NO參與腫瘤細胞的凋亡過程。50%以上腫瘤可檢測到p53基因突變,NO引起DNA損傷也促使p53蛋白積聚而使細胞生長抑制乃至引發凋亡[21]。隨著NO在腫瘤生物學研究的深入,將對腫瘤發病及其治療提供有益的啟示。

5NO的毒理學

內源性NO以pmol/L或fmol/L濃度存在時,可激活G蛋白,參與信息傳遞。以nmol/L濃度存在時,則誘發細胞毒性和損傷DNA,導致基因突變和癌變。同時,NO還能抑制某些與細胞呼吸和DNA復制有關的關鍵酶活性,使細胞能量代謝和DNA復制轉錄發生障礙,從而影響細胞的生長、發育和分化。另外,NO的一系列氧化還原形式,一方面作為還原物質清除引起脂質過氧化發生的物質,另一方面也介導、引發脂質過氧化發生。吸入NO時,產生的過亞硝酸鹽對肺泡表面活性物質的功能有不良影響。TK6人成淋巴細胞接觸NO(5.5～22mmol/L)后,其DNA單鏈斷裂,并隨著劑量的升高和時間的延長而增加[22]。活化巨噬細胞產生的NO也誘發靶細胞中DNA鏈斷裂,這種損傷可被L-NMMA抑制。NO通過氧化使胺亞硝基化,進而使DNA、RNA、腺嘌呤和鳥嘌呤發生脫氨基作用,產生的脫氨產物隨NO濃度增加而增加。NO對培養的哺乳動物細胞有誘變作用。在TK6細胞培養時,直接通以5.5～22mmol/LNO1h,經6d表達,NO誘發TK基因位點和HPRT基因位點突變,并與濃度有依賴關系。SD大鼠吸入一定濃度的NO,將其肺細胞原代培養,結果也表現出誘變性。NO供體藥物SNP能誘發g12細胞gpt位點突變和雙微核形成,并與NO2-含量升高呈正相關。提示SNP釋放的NO過量積累可能是導致g12細胞遺傳毒性的主要原因。NO是沙門氏菌TA1535的強誘變劑。在NO濃度為12.3mg/m3時,回復突變數為本底的10倍,回變體隨劑量增加和接觸時間延長而增加,TA1535基因突變譜多是C→T轉換。NO供體藥物能誘導TA1535回復突變,其中精氨-NO復合物誘發的回變率可高達本底的100倍[23]。NO表現出的致突變性與DNA堿基脫氨和錯誤修復以及自由基致DNA氧化損傷有密切關系。

6結語

NO具有廣泛的化學反應性和作用位點,介導和調節許多器官系統的生理、病理生理功能。它是一把雙刃劍,即有作為生物信使和免疫調節的有利的一面,也有潛在的毒性。目前國內有關NO及NOS的研究報道正逐年增多,但在獸醫界自1997年后才由中國農業大學在NO與寄生蟲感染方面開始研究,更多的研究仍在機理方面。雖然有NO混合氣體直接吸入、NO供體藥物和NOS抑制劑治療諸多疾病的報道,但距實際臨床應用仍有一定距離,其有效性和安全性仍需進一步評估。綜上所述,應考慮在以下幾個方面開展研究工作。(1)探討在某一條件或處置前后,動物、器官、組織或細胞NO含量和NOS活性的改變,及NO供體藥物和NOS抑制劑對生理和病理生理的影響,以揭示機理,拓展思路,為疾病防治提供依據。(2)開展NOS的分子生物學研究。包括NOS組織定位、提取純化及分型、基因序列分析、檢測NOSmRNA、克隆NOS基因,通過載體使基因轉入細胞,用于某些治療目的等。(3)開展NO供體和NOS抑制劑的藥理毒理學研究,開展已有藥物的NO/NOS機制研究,為藥物作用機理和新藥研發提供依據和方法。