膠原應用及發展
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1膠原的結構
資料表明[5],皮膠原的形成可以簡略地表示為:氨基酸→多肽→原膠原分子→膠原微纖維→膠原纖維。很明顯,皮膠原的單體是原膠原分子。原膠原分子呈細棒狀,長20nm,直徑1.5nm,相對分子量接近300×103。每一個原膠原分子均有3條肽鍵,每條肽鏈上有1052個氨基酸。在N端尾肽和C端尾肽之間的1011個氨基酸殘基的排列很有規則,反復出現甘XY三肽(X、Y分別代表其它氨基酸)而形成結構穩定的螺旋區。螺旋區內的甘XY三肽共有337個,其中1/3是甘脯X三肽。此外,在螺旋區內還有1/4是酸性和堿性氨基酸殘基。由于在α肽鏈上出現了甘脯X三肽而形成了膠原所特有的、結構緊密的左手螺旋。3條具有左手螺旋結構的α肽鏈,通過互相折疊盤繞形成右手復合螺旋。皮膠原的結構穩定性一方面依賴于靜電作用、氫鍵、范德華力、氨基酸的親水性和疏水性、配位鍵及二硫鍵等來維持。另一方面皮膠原分子內和分子間所存在的醛醇縮合交聯、醛胺縮合交聯和醛醇組氨酸交聯等對提高皮膠原結構的穩定性發揮著重要作用。
2皮膠原的主要性質
2.1膠原的理化性質
膠原是一種蛋白質,是由氨基酸組成,因此其理化性質必然與氨基酸的理化性質相同或相關,例如兩性電離及等電點、紫外吸收性質及呈色反應等。同時膠原又是生物大分子化合物,還具有膠體性質、沉淀、變性和凝固等特點。此外,酸、堿、鹽和蛋白酶等都可以與膠原發生化學作用,膠原在酸或堿的長時間作用下,其交聯鍵會遭到破壞而發生膠解。不過,多數蛋白酶對膠原的作用機理至今尚不清楚,其作用過程也難以控制。中性鹽與膠原的作用依其種類不同而各不相同,有的中性鹽可使膠原脫水,有的則會引起膠原膨脹(即充水)。膠原的耐濕熱穩定性是衡量膠原結構穩定性的一項重要的物理指標。迄今為止,在制革生產和科學研究中,人們普遍采用測定皮膠原的收縮溫度(shrinkagetemperature)的方法來判定膠原的濕熱穩定性。
2.2膠原的物理———機械性能
若干具有三股超螺旋結構的Ⅰ型膠原分子通過側向共價交聯、錯位階梯式排列聚集成直徑為50~200nm的膠原微纖維。膠原微纖維再進一步側向排列形成膠原纖維。正是由于膠原纖維具有如此復雜且特殊的分子結構,才使得膠原纖維具有優良的力學性能[6]。顯然,膠原的物理機械性能主要取決于它的化學組成及交聯程度。此外,膠原的螺旋結構對膠原的物理機械性能也有著舉足輕重的影響。應力-應變實驗結果表明,作為天然高分子化合物的膠原表現出彈性態和粘彈態兩個階段的力學行為。而變性膠原(沒有螺旋結構)僅表現為少許彈性態性質,其斷裂拉力僅為天然膠原的一半[7]。
2.3皮膠原的生物醫用性能
(1)皮膠原具有作為生物醫用材料最適宜的微孔徑,而且其分布量大,這些特點賦予材料以較好滲透性,適于營養物質、生物因子擴散及血管長入。(2)創面止血和緩解疼痛的功能。有文獻報道[7],膠原可以促進血小板凝聚和血漿結塊,從而達到創面止血的目的。有人認為[8],膠原使血小板凝聚能力似乎來自游離的氨基酸側鏈氨基。封閉膠原側鏈羧基,雖然不會造成凝聚能力的明顯下降,但是卻會減弱膠原促使血漿結塊的作用?？傊?膠原所具有的超分子結構,是其凝聚能力的基礎。關于膠原的緩解疼痛功能,雖有臨床現象證明,但目前尚未得到合理的解釋。(3)誘導并促進細胞生長。膠原的粘附性良好,對成纖維細胞有一定的生物誘導性,有利于細胞的長入及基質沉積、新生血管生成和傷口愈合。臨床已有報道,在膠原蛋白凝膠中培養肝細胞誘導聚集體的形成,從而使每個細胞合成白蛋白的量比非聚集體增加2倍[8]。(4)可生物降解性[9]。膠原在生物酶作用下可以部分或全部水解。利用膠原的可生物降解性,人們設想當膠原類材料植入人體后,新生組織或器官即可將其作為支架開始生長,長成后,膠原類材料自行降解為小分子被人體吸收,從而達到徹底治療的目的。然而膠原類材料的降解情況受局部因素的影響較大。膠原類材料的降解速度的可控性不如合成材料。因此,在這方面必須進行大量的研究。膠原的可生物降解性具有二重性。膠原類材料植入人體后,如果降解速度過快,則新生組織或器官尚未長成,達不到預期目的;如果降解速度過慢,則會影響新生組織或器官的生長。理想的情況是尋求最佳的降解速度。
3膠原在醫學領域中的應用
膠原的結構與性能表明它是一類優良的可用于引導組織再生的生物材料,已經廣泛地應用于醫學領域中。
3.1天然真皮替代物
主要有2種類型:一種是除去表皮層的異體真皮;一種是無細胞真皮。無細胞真皮可以是異體皮,也可以是人皮。關于無細胞異體真皮及無細胞真皮的應用,國內外均有報道,可用于治療深度燒傷創面。而無細胞人體真皮的來源十分有限,特別是存在傳播惡性疾病的危險(尤其是艾滋病)。由于上述原因,在很大程度上,天然真皮替代物的應用受到限制。
3.2人工皮膚
眾所周知,組織工程材料的第一個面市的商品是人工皮膚,也是到目前為止在臨床應用方面最為成功的材料之一,這方面的報道很多[10~13]。已經報道的人工皮膚的制造方法有很多種。Yannas等人首先用膠原硫酸軟骨素多孔交聯支架成功地制得人工皮膚,據臨床報道,這種人工皮膚已被美國FDA批準,其商品名稱為Dermagraft,主要用于嚴重燒傷和糖尿病患者皮膚潰瘍的治療,對慢性皮膚潰瘍也具有很好療效。但是已有的人工皮膚都存在結痂及易引發各種炎癥甚至導致癌變,而且應用范圍極為有限。1998年5月,美國FDA又批準了馬薩諸塞州坎頓器官發生有限公司的一種名為Apligraf的人工皮膚生產。據報道,這種人工皮膚是一種人工兩層皮膚,表皮在上,真皮在下。具體制造方法可能是從牛腱中提取膠原,經純化后,制成膠原膜,再經過殺菌、消毒即可使用。有的則對膠原膜進行交聯,經殺菌、消毒后備用。也可以將膠原膜作為基質材料在其上種植上皮細胞經培養而制成人工皮膚。這一類人工皮膚均有助于因腿部血液循環不暢引起的靜脈潰瘍患者的傷口愈合。此外,國內外還報道了膠原GAG/PGL網成纖維細胞真皮替代物、膠原殼聚糖人工真皮及膠原粘多糖復合組織工程支架材料等等。由此可見,過去國內外基于皮膠原的組織工程材料主要是明膠、膠原凝膠及其與天然生物材料、高分子化合物的混合物。迄今為止,已有的人工皮膚或醫用膠原膜的應用范圍極為有限,所有的人工皮膚都不能全面地滿足醫療手術的要求。究其原因,主要是存在以下不足:(1)作為皮膚的替代物,由于不能重建毛囊、汗腺、脂腺等皮膚附件,從而在相當程度上降低了患者對環境的適應能力;(2)血管化較慢;(3)抗感染能力差;(4)力學性能差,在含水條件下難以塑形,不利于人體內部器官的重建;(5)體外及新生組織細胞產生的膠原酶極易將其降解。材料在體內降解吸收過快,使得材料不能與體內的組織細胞生長、增殖的速度相匹配等等。針對上述問題,研究者們主要采取了三個方面的措施:第一,通過對人工皮膚或醫用膠原膜的改性來提高其力學性能;改性的方法主要是物理方法交聯(如熱交聯、UV和γ射線交聯等)、化學方法交聯(如使用甲醛、戊二醛進行交聯)、接枝改性(如使用RGD肽)及低溫等離子改性等等;第二,多種材料復合,提高其綜合性能;第三,使用生長因子。研究人員通過利用促進血管形成的生長因子包裹支持組織的多聚物載體而成功地促進了在實驗室里生長的生物人工組織的血管發生。
3.3可注射性膠原
主要用于整形美容,是糾正皮膚凹陷型缺陷的最理想材料,其主要適應證為皺紋、尋常痤瘡疤痕、小型外傷疤痕等缺陷的填充矯正。此外,對糖尿病患者在其病變部位注射膠原有助于足部潰瘍和褥瘡的修復。應用較為廣泛的膠原植入物是可注射性膠原溶液,主要用于矯治由于年老、創傷、疾病和先天性畸形所引起的外形異常等。
3.4可降解膠原縫線
由于膠原植入物在人體內會降解為氨基酸而被人體吸收,因而利用膠原制成的膠原縫線用于特殊的醫療手術具有重要意義。臨床應用表明,可吸收的膠原縫線用于眼科的角膜手術中,很少有不良反應。此外,還有關于在動物實驗中利用經過純化的膠原膜(厚度0.0013mm)作角膜移植并用液狀膠原替代晶狀體的報道。
3.5止血海綿
研究表明,膠原不僅能夠誘導血小板附著,產生釋放反應,而且能夠激活血液的凝固因子,粘接在滲血的傷口上,對已經損傷的血管起填塞作用,從而達到止血的目的。臨床應用表明,與藻酸鈣、藻酸海綿、凝血增強纖維泡沫、增凝明膠海綿及氧化纖維素等常用的止血劑相比,膠原的止血率高,副作用小,因而是一種理想的止血材料。利用膠原研制膠原止血海綿,國外一直十分活躍,國內目前尚處于起步階段,但發展還是很迅速的。據報道,國外已經有粉狀及片劑的微晶膠原止血劑[14]、纖維織物止血劑和海綿止血劑等。一種取自牛跟腱的無過敏性、無菌異種凍干膠原已廣泛應用于臨床,并取得良好效果。國內也有類似產品問世[15]。
3.6組織引導材料
據報道,目前國內已有醫用組織引導再生膠原膜產品面市。臨床應用表明:此種醫用膠原膜具有特有的網狀結構,可參與組織愈合過程并能引導、促進細胞生長;具有顯著引導/誘導組織再生的作用,使創面實現功能性、再生性的愈合;物理機械性能優異,手術操作簡便,生物相容性好,無抗原性,不引起三致反應,可降解、吸收,不需二次手術取出;可廣泛應用于軟、硬組織損傷的修復,如口腔科、骨科、整形外科、五官科、神經外科及肌腱斷裂和臟器穿孔等的治療。與此材料匹配的是膜引導組織再生技術(GTR技術)。GTR通過引導膜機械地阻礙非目的細胞(如表皮細胞)進入組織修復區,可使目的細胞(如骨細胞)在修復區濃集,以達到組織定向修復的目的。GTR技術最早應用于四肢長骨,20世紀80年代初,逐漸應用于口腔科。GTR引導膜主要有2種:一種是非生物降解膜,如聚四氯乙烯膜;一種是可生物降解膜,主要有膠原膜和凍干硬腦膜等。由于非生物降解膜較堅硬,易造成軟組織裂隙、膜暴露、細菌感染等,且需要實施二次手術除去,故在臨床中已傾向于采用可生物降解的GTR引導膜。
3.7用于骨組織工程中的“Ⅰ型膠原X”植入材料
Ⅰ型膠原是骨骼中的主要結構蛋白,約占有機基質的90%。膠原在骨組織工程中可以有3種作用:①作為支架材料,可為骨細胞的長入提供支架,促進新骨生成;②利用膠原的止血性能;③具有覆蓋陶瓷或金屬植入物的功能。目前,國內外一般利用膠原與羥基磷灰石結合制成復合材料,植入人體,以修復骨缺損。例如,瑞典開發出一種Colipat植入物,它就是由從豬皮中提取的膠原與純度為90%的羥基磷灰石以5∶1的比例混合制成。據報道,該材料已用于臨床實驗,結果證明無炎癥反應,且具有良好的生物相容性。由Zimmer等公司開發出的作為植骨替代物的生物材料被稱為Collagraft,其中含有從牛真皮膠原中提取的純化膠原纖維絲和羥基磷灰石/三磷酸鈣陶瓷,可將Collagraft與自體骨髓相混合,自體骨髓能提供成骨前體細胞。臨床應用表明,大多數患者對膠原未發生免疫反應。即使有些患者產生牛膠原抗體,對植入物的療效和安全性也均無影響。
4展望
大量的研究結果表明,膠原的性能可以滿足用于作為表皮細胞、成纖維細胞、角膜細胞、軟骨細胞及骨細胞的培養基質。但是,利用膠原制做組織工程支架材料,尚存在以下亟待解決的問題:(1)力學性能差,在含水條件下難以塑形,故不宜用于內部器官的重建;(2)體內及新生組織細胞產生的膠原酶極易將其降解;在體內降解吸收過快,不能與組織細胞生長繁殖的速度相匹配;(3)為提高膠原的力學性質和降低其在體內的降解吸收速度,使用戊二醛對膠原進行交聯,形成網狀交聯大分子,但戊二醛用量較難控制,過量時引起膠原制品發黃,產生毒性,不利于組織細胞培養生長,量少時達不到改進膠原性能缺陷目的。筆者認為解決上述問題的基本途徑主要有:
(1)采用脫細胞技術制造天然的胞外基質(ECM)作為組織工程支架材料,其優點在于這種天然的ECM在體內可以組織填充物而長期存在,有較好的組織相容性和親和性,還可以誘導和調節細胞的生長、繁殖和分化等。
(2)采取物理、化學交聯方法,克服膠原材料(主要是凝膠、膜等)所存在的降解吸收快、機械強度小的缺點。主要改性方法有①物理方法,如熱交聯、UV和γ射線交聯等;采用物理方法交聯的優點是不會引入有毒化學物質,但不易獲得很好的交聯強度,交聯的均勻程度也不理想;②化學方法,通常采用戊二醛、甲醛進行交聯。采用化學方法交聯,可以獲得均勻一致的交聯,但交聯過程可能會引入有毒的交聯劑和產生不良的副反應。據報道,用酰基疊氮或聚環氧化物交聯,既不會引入明顯的毒性,又可獲得理想的交聯效果。此外,對膠原材料的低溫等離子改性和用RGD肽(精氨酸甘氨酸天冬氨酸)接枝改性,可進一步改善膠原材料的生物學性能,提高其促進細胞粘附和增殖功能。
(3)制備膠原基復合材料,為改善膠原材料的性能,利用膠原與其他合成材料、天然生物材料復合來制備膠原基復合材料已經成為一個重要的發展方向。目前主要有①膠原透明質酸(HA)的復合物系統,它可以作為可注射骨替代材料;②膠原殼聚糖;③膠原poly[HEMA]與乙醇混合,用過硫酸銨和偏亞硫酸鈉引發交聯反應,制成燒傷用的貼膜,在膜中加入藥物吲哚美辛。實驗表明:膠原poly[HEMA]Ⅲ型膠原的復合物所具有的多孔海綿狀結構是良好的藥物釋放系統,是制備燒傷用創面敷料的良好材料。
總之,解決上述問題后,膠原在醫學領域中的應用前景將會更加廣闊。
