激光共焦掃描顯微鏡的作用
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在使用普通光學顯微鏡時,由于光的衍射極限造成的分辨率的限制與在高分辨率時顯微鏡的聚焦深度很小之間的矛盾一直沒有解決。自激光發明以來,激光在顯微鏡中的應用日益廣泛,如利用激光的相干性成功的研制了全息顯微鏡,利用激光的單色性作為熒光激勵源設計成功的激光熒光顯微鏡等等。近十年來,隨著激光掃描測量圖像技術的發展,將其應用于顯微領域從而形成了一種新型的顯微鏡———激光共焦掃描顯微鏡(LaserConfocalScanningMicroscope,簡稱LC-SM),給傳統的顯微鏡領域帶來了革新〔1,2〕。
2LCSM系統的結構
LCSM系統由激光光源、掃描頭、顯微鏡和圖像處理系統四個基本組成部分組成。
2.1激光光源目前可供LCSM系統選做激光光源的激光器有三種:(1)Ar+激光器。用空氣進行制冷;功率為25mW;能夠輸出波長為488nm和514nm的兩條譜線;每條譜線功率為10mW。(2)Kr+/Ar+型混合氣體激光器。功率為15mW;可供選擇使用的有波長為488nm(約5mW)、488nm/568nm(約5mW)和647nm(小于5mW)的譜線。(3)Ar+(25mW)和He/Ne(0.3mW)雙激光系統。能夠輸出的譜線的波長為488nm、514nm和543nm。本實驗室的LCSM系統是美國Bio-Rad公司產MRC-600型共焦掃描顯微鏡,所使用的激光器是Ar+激光器。
2.2掃描頭
掃描頭是系統最關鍵的組成部分。此裝置為雙通道:有兩個光電倍增管(PMT1、PMT2)可同時用來接收光信號,能夠對同一觀測物所發出的兩種光信號進行同時觀察,大大提高了效率并能進行實時對比。在使用通道1時,調節MIRROR1和MIRROR4,使照射到樣品上的激光能夠實現良好的聚焦,在使用通道2時,調節MIRROR5可實現同樣的目的。IRIS2和IRIS2是兩個可變光闌,能夠限制進入光電倍增管的光信號的量,并能濾除雜散光,提高成像質量。FILTERSET1和FILTERSET2是兩組濾光片,使用不同的濾光片得到所需要的不同波段的光。
2.3顯微鏡
一般情況下,LCSM選用熒光顯微鏡,可獲得三種光信息:(1)反射光(或散射光)信息:激光聚焦的小亮點照射在樣品表面,在樣品表面發生反射和散射,反射光(或散射光)經過物鏡后,被安置在物鏡像方的光電檢測器(如光電倍增管)接收,再將所接收信號送到計算機處理,能夠得到光強度及二維、三維圖像等信息。(2)透射光信息:將透過樣品的光用聚光鏡聚焦或用光纖收集后,經過與(1)相同的處理過程,可以獲得所需透射信息。(3)熒光信息:有些樣品在激光照射后將產生熒光,熒光經物鏡進入光電檢測器得到熒光信息。探測這類光信息的顯微鏡稱為“激光熒光掃描顯微鏡”。
3LCSM系統的原理
LCSM采用共軛焦點技術,使光源、被照物和探測器處在彼此對應的共軛位置,光源通過系統在樣品上得到的會聚點與目鏡的焦點相重合,形成共焦。掃描是通過移動樣品或移動光點的方法實現的。LCSM的基本原理是:平行的激光束從物鏡的像方,向物鏡照射,并在樣品上由物鏡聚焦成一直徑很小的亮點。此亮點對樣品進行二維掃描(可以是物面掃描,也可是像面掃描),將所獲二維信息輸入到計算機處理,從而獲得三維圖像信息。光源經物鏡在樣品表面銳聚焦成衍射極限的斑點,其反射光或透射光再次通過物鏡或聚光鏡在空間濾波器的共焦針孔平面成像。由靠近像面位置的探測器接受光信號。由于光照和探測都限制在樣品的一個點,通過對視野內所有的點逐個掃描即能獲得樣品的整個圖像。而在普通的光學顯微鏡中是把物體作為平面圖像進行觀察的,容易產生不必要的散射光和閃爍引起的對比度降低。因而,與傳統的顯微鏡相比,LC-SM提高了成像的分辨率。
4LCSM的光學特性
4.1提高分辨率和圖像反差
先對LCSM的光學性能進行分析。為分析方便,假定激光器為單模輸出,其徑向振幅分布為高斯函數:E(u)=E0•exp(-U2/2σL2)(1)(E0為最大振幅,σL為此高斯函數的物征系數)激光束一定要被聚焦到物平面上形成一個小亮點,這個小亮點的振幅分布是(1)式的傅里葉變換:IL(X)=I0•exp(-2πσL2X2/λ2f02)(2)(λ為激光波長,f0為使激光束聚焦的等效系統的焦距。)再看顯微鏡成像光路,有兩種情況:第一種情況:由(2)式描述的激光聚焦小亮點的直徑6σLβ≥顯微鏡像面衍射圖形中心亮斑的直徑時,此時的像面振幅分布函數I(X′)由兩部分組成:(1)顯微鏡產生的點像分布函數據為K(X′);(2)激光在物面聚焦的亮點的振幅分布函數(折到顯微鏡像面上為IL(X′)=I0•exp(-2πβ2σLX/2/λ2f02,β為顯微鏡的放大倍數)。用卷積法把這兩部分合成為:→I(X′)=IL(X′)•K(X′)=I0exp(-2πβ2σL2X/2/λ2f02)∫K(ξ)exp(-2πiX′ξ/λS)dξ(3)(2a為顯微鏡光瞳直徑,ξ為坐標,K(ξ)為光瞳函數)假設物鏡是理想的,則當-a<ξ<a,K(ξ)=1當ξ<-a<或ξ>a時,K(ξ)=0于是,(3)式變為I(X′)=I0exp(-2πβ2σL2X/2/λ2f02)∫-aK(ξ)×exp(-2πiX′ξ/λS)dξ(4)當σL→0時,即I(X′)→σ(X′),也就是說,使激光聚焦亮點直徑很小,根據卷積公式的基本性質,可得I(X′)→∫K(ξ)exp(-2πiX′ξ/λa)dξ(5)從上式可看出,其像面上的點像振幅分布函數也只是再現顯微物鏡的點像振幅分布,其分辨本領不會有所改善。第二種情況:由(2)式描述的激光聚焦小亮點的直徑6σLβ<顯微鏡像面衍射圖形中心亮斑的直徑時,此時激光聚焦產生的小亮點不僅起到了前面描述的卷積作用,還起到了像面針孔作用,由它截取(3)式所描述的點像中心部分的振幅分布函數如下:當X′<-3σLβ或X′>3σLβ時,I(X′)=0當-3σLβ<X′<3σLβ時,I(X′)=I0exp(-2πβ2σL2X/2/λ2f02)∫-K(ξ)exp(-2πiX′ξ/λS)dξ(6)由(5)式可以得到以下有關分辨本領的結論:(1)LCSM的點像直徑基本上由激光聚焦的小亮點決定。傳統的顯微鏡在32×時,N.A.≈0.5,在λ=632•8nm,其彌散圓直徑≈0.5um。而激光聚焦光點直徑d=f•θ/Г,f為物方焦距,θ為激光發射角,Г為擴束望遠鏡倍數,聚f=3mm,θ=3′4,Г=10X,則d=0.3um,即LCSM的分辨本領比傳統顯微鏡提高一倍左右,當系統仔細設計時,可望達成2~4倍。(2)LCSM點像能量分布既不是高斯函數,也不是愛里衍射圖形,而是它們的卷積,這一卷積將使愛里衍射圖形平滑,即使提中心高斑之外的亮環亮度減弱甚至完全消除,這一作用將提高圖像的反差,有利于顯微鏡觀察生物體、細菌的細節甚至于內部結構。
4.2獲得實時圖像
LCSM對樣品進行二維掃描,有兩種形式:一是移動樣品進行掃描,但物面信息攝取速度太慢,得到一幅圖像要幾十秒到幾分鐘。二是移動光點進行掃描,其光束掃描采用電流反射鏡偏轉光束進行掃描實現的。得到一幅圖像需幾秒到幾十秒。美國研制的利用聲光偏振器產生實時視頻圖像的LCSM〔3〕,1/30秒便可獲得一幅圖像〔4〕,大大提高了激光共焦掃描顯微鏡的性能,已無“掃描”的概念,似乎是“實時輸出”的顯微鏡了〔5〕。
4.3層析技術
LCSM把光束聚焦到樣品的某個層面,而把該層面前后的離焦光束掃掉,通過改變聚焦的深度便可獲得樣品的一個個層面的光學切片圖像,即層析技術。層析技術在激光掃描術中的早期應用是研究半導體的局部特性,現在則應用于激光共焦掃描顯微技術進行細胞或生物體的結構分析,其主要信息來源是收集激光從細胞或生物體的表層進入內部所產生的散射光信息。如果對被觀察的生物樣品進行了熒光著色,那么就可以收集到不同激光照射截面的熒光信息。它與電子顯微鏡相比,無需進行超薄切片就可對活體進行層析觀察,這正是生物學、醫學研究所十分希望實現的新技術。
5LCSM在生物、醫學中的應用
利用LCSM在生物、醫學領域中已經進行了大量的研究工作,下文將從幾個方面對該類工作做簡要介紹。
5.1細胞Ca2+的研究
Ca2+做為細胞內重要的第二信使,對它的研究是當今生命科學研究領域的一大熱點。在LCSM出現之前,對Ca2+的研究大都是通過死細胞進行的,所以無法對細胞內的Ca2+信號進行動態觀察,而Ca2+信號的動態變化是反映細胞生理過程及生理變化的重要信息。利用死細胞進行研究,就無法對同一個細胞或同一組細胞的不同生長階段進行觀察,缺乏對比性,也大大降低了可信度,并給研究工作帶來了困難。而LCSM技術從根本上解決了這個問題,利用LCSM觀察活細胞Ca2+動態變化可以并且已經獲得了大量信息。到目前為止,此項技術應用于動物細胞的研究居多。通過對單細胞Ca2+的研究發現,Ca2+不僅在細胞局部區域間的分布是不均勻的,而且細胞內各局部區域的不同深度或層次間也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂空間Ca2+梯差〔6,7〕。細胞在受到外界刺激(如A23187、KCl、Ionomycin、Trition等)時,Ca2+熒光信號強度會發生很大的變化〔6,7,16〕,隨著刺激時間的增長,即使刺激物繼續存在,細胞Ca2+熒光信號不但不會繼續增強,反而會慢慢減弱,直至回復到未加刺激物時的水平。對于細胞受精過程中Ca2+熒光信號的變化情況,也已經有人做過研究〔8〕。研究發現,配子在粘著過程中,Ca2+熒光信號未發生任何變化,而配子之間發生熔合作用時,Ca2+熒光信號強度卻會出現一個不穩定的峰值,并可持續幾分鐘。這些現象,對研究受精引發的早期信號及Ca2+在卵細胞激活和受精卵的發育過程中的作用具有重要意義。在其它一些生理過程如細胞分裂、胞吐作用等,Ca2+熒光信號強度也會發生很顯著的變化。Ca2+是重要的第二信使,對于調節細胞的生理反應具有重要作用,開發和利用LCSM技術對Ca2+熒光信號進行觀測,可以從某些方面對有機體或細胞的生理變化機制進行分析、闡述,具有重要意義。
5.2細胞骨架的研究
細胞骨架在維持動植物細胞的形態、細胞分裂等生命活動中有著重要的作用,細胞內的骨架主要由微管和微絲組成,標記有熒光染料的微管和微絲的特異性抗體(如FITC-Phall,TRITC-Phall,RHODA-Phall等)與微管和微絲結合后,利用LCSM可觀察到微管和微絲的具體形態。在細胞發生某些生理變化時(如外界刺激引起的內皮細胞膜下Ca2+濃度升高),微管和(或)微絲的結構及其位置也會發生相應的變化,利用LCSM不僅可以對其位置進行定位,而且可以對其位置變化進行動態觀察,從而可進一步探討微管和微絲在細胞生理中的作用機理〔10-14〕。
5.3病變細胞的研究
病變細胞與正常細胞的內部結構以及在外界刺激下的細胞反應是有差別的。如果能對某個生理過程進行特異性熒光標記,那么就可利用LCSM對其熒光信號進行監測,從而獲得病變細胞與正常細胞的不同信息,供進一步研究。比如,使GFP(綠色熒光蛋白,GreenFluorescenceProtein)基因整合到病毒基因,利用LCSM實時動態的探測GFP發出的熒光,就可以判斷病毒侵染細胞的過程、侵染條件及抑制條件。這就極利于及早發現病變跡象,以獲得及時治療。
5.4藥物效用的研究
探討藥物在細胞水平上的作用部位、空間分布和作用時間,對提高藥效及研制新藥具有重要的積極作用。利用LCSM不僅可以對藥物在細胞中的分布及其所引起病變細胞的變化進行動態觀察〔15〕,而且還可以通過觀察在不同時間段內藥物與其作用點(比如DNA)的結合情況,判斷服用藥物的最佳時間,這樣就可以進一步提高藥效。另一方面利用LCSM還可以判斷新藥品的藥效。LCSM在藥物研究領域具有廣泛的應用前景。
6結束語
LCSM系統是一種集激光、顯微鏡和計算機于一體的新型、高精顯微鏡。LCSM具有的共焦成像分辨率高、能層析掃描無需制作繁瑣的電鏡切片以及能觀察樣品的三維圖像等優點,使其與生物技術相結合是生物、醫學研究領域的一種強有力的儀器,有著廣闊的應用前景。
